癌症患者的微生物組研究顯示，許多實體瘤中存在多種細菌，動物實驗顯示全身給細菌後，細菌可選擇性的定值在腫瘤核心區域，這引起了人們對使用和修飾細菌作為癌症療法的極大興趣。因此，細菌工程成為當前的一個研究熱點。

細菌工程

是合成生物學的一個新興領域，

合成生物學

將分子生物學、系統生物學與工程學相結合，用以設計人類想要的物質，如抗腫瘤物質等。目前，由於缺乏可快速、動態、高通量篩選細菌的體外測試環境從而限制了其在臨床應用中的發展。

鑑於此，來自

哥倫比亞大學生物工程系、資料科學研究所、赫伯特·歐文綜合癌症中心的Tal Danino等人開發了一個3D多細胞細菌球狀共培養（Bacteria spheroid coculture，BSCC）系統

，可適用於多種腫瘤細胞型別和細菌種類，並能利用動物模型進行驗證，大大促進了工程微生物療法的快速發展。

詳細方法以protocol形式以題為《A rapid screening platform to coculture bacteria within tumor spheroids》於2022年7月29日發表在《Nature Protocols》上，該系統測試了腫瘤感測基因迴路、表徵了細菌介導的腫瘤發生、篩選了抗腫瘤有效載荷、概括了體內治療結果，達到體內系統無法實現的篩選規模，提高了微生物療法和腫瘤-微生物相互作用研究的通量和可及性。

（圖1）

圖1。 BSCC系統評估微生物-癌症的相互作用和其療效

簡介

1。開發方法

理想的共培養系統必須同時滿足幾個標準：1）兩個群體穩定共存，可縱向檢測細胞相互作用和反應；2）很好的模擬生理狀態下的細菌和腫瘤反應的實體腫瘤微環境；3）適用於多種腫瘤和菌株，促進該領域的標準化和可及性。表1列舉了現有方法，發現其很難同時滿足上述功能。在此對比了BSCC和現有的培養體系，其表現出一定優勢。

表1。 現有菌癌共培養體系的比較

優勢體現在BSCC利用了3D腫瘤球體的優勢，同時解決了細菌過度生長造成的限制。這是透過使用重複洗滌步驟、在周圍培養基中新增瀰漫性差的抗生素（慶大黴素）的方法，將細菌生長限制在腫瘤壞死核心中來實現的（圖2）。

圖2。 建立BSCC系統的工作流程示意圖

同時，BSCC系統同時表徵細菌和腫瘤細胞，並與許多標準測定和儀器相容，用於下游實驗和分析，而這些試驗和分析是其他實驗裝置難以實現的（圖3）。例如，延時顯微鏡可以分析細胞的時空動力學（球體大小、細菌分佈和基因表達動力學）。並且在任何時間點，都可以輕鬆提取單個腫瘤球體以進行測定（活力、組織學和細菌集落計數）。

圖3。下游檢測及其效用

2。方法概述

該方案詳細介紹了以下幾個方面（具體見全文）：

細菌培養和腫瘤球體形成：包括腫瘤細胞的擴增和接種，在腫瘤求體內共培養細菌，去除腫瘤球體外細菌，分析細菌生長軌跡等。

基因迴路動力學。

體外治療效果監測。

體內驗證BSCC篩選候選藥物的療效。

3。比較其他方法

許多關於細菌與癌細胞相互作用的早期研究都是透過將細菌新增到單層腫瘤細胞上進行的。方法簡單，但是忽略了細菌和腫瘤生長速率不同，細菌迅速生長耗盡培養基的營養物質，從而導致腫瘤細胞死亡，使得時間太短，無法觀察到細胞相互作用和反應。在此基礎上，後人添加了Transwellw物理分離細菌和細胞，這種方法限制了細菌的營養掠奪，但是卻有損細菌和癌細胞的相互作用。

進而衍生出微流體系統用於研究細菌和腫瘤細胞的共培養。先將腫瘤細胞接種到微流體通道中，然後接種細菌，這種方法可很好的表徵細菌密度和抗腫瘤功效評價。但這需要專門的裝置，並難以實現高通量。因此，高通量和可及性並不高。

大多數單層細胞和微流體系統的一個關鍵缺點是缺乏某些生理條件，如細胞幾何形狀、代謝物和氧梯度。

因此，3D培養系統越來越多地用於研究廣泛的生物學問題，並被認為是進行藥物療效研究的更相關的模型。以前使用3D培養系統的研究試圖透過新增微流體來製造腫瘤晶片系統，將細菌顯微注射到腫瘤類器官的核心，以促進細菌腫瘤定位，並使用嚴格的厭氧細菌或滅活細菌來控制腫瘤外細菌的過度生長，來解決微生物快速過度生長的問題。但是，這些方法需要複雜的技術和專業的裝置，因此高通量和可及性也不高。

與這些系統相比，BSCC提供了一種簡單穩定的3D共培養系統，可在生理腫瘤環境中對細菌進行高通量和縱向表徵。

4。BSCC的優勢和缺陷

BSCC系統的一個優點是可以很好的模擬腫瘤環境中的細菌定植（可看到腫瘤壞死和細菌在缺氧中心生長）。BSCC可實現高通量並且可及性高，只需要用標準組織培養的96孔板和懸浮培養裝置，可同時測量大量的細菌菌株、腫瘤型別、基因迴路和治療手段，並在時空兩個層面進行表徵。普通實驗室也可以實現。

但該技術仍有一定的侷限，例如在實體瘤微環境中缺乏細胞型別異質性（免疫細胞、基質細胞、脈管系統等）以及有幾種細菌（對慶大黴素耐藥的細菌）不相容性等。該系統仍有改進的空間。

5。本文試驗設計

腫瘤球體：小鼠結直腸癌細胞系CT26和MC26、小鼠乳腺癌細胞系4T1、人結腸癌細胞系HT29

細菌：衰減型鼠傷寒沙門氏菌（ELH1301）、其他鼠傷寒沙門氏菌菌株（ELH430、SL7207和VNP20009）、單核細胞增多性李斯特菌（L。monocytogenes），奇異變形桿菌（P。mirabilis）和大腸桿菌（E。coli）（細菌可帶光學標記便於追蹤，如sfGFP）

引數和條件：評估不同濃度慶大黴素共培養的結果。餘見表2。

結果：見圖4。

表2。共培養的重要引數

圖4。各種細菌和腫瘤細胞共培養

材料

生物材料：

細胞系：CT26，、4T1 、 HT29 買自ATCC。 cat。 nos CRL-2638 （RRID： CVCL_7256）， CRL-2539 （RRID： CVCL_0125） ， HTB-38 （RRID： CVCL_0320）。從K。 Tanabe和B。 Fuchs獲得的MC26細胞系（馬薩諸塞州總醫院，RRID：CVCL_0240）。從達尼諾實驗室庫存獲得的紅外RFP（iRFP）轉染CT26細胞系。菌株：從Elizabeth Hohmann博士獲得的鼠傷寒沙門氏菌ELH1301和ELH430的減毒菌株；SL7207從齊格弗裡德·魏斯獲得。從埃裡克·帕默（Eric Pamer）獲得的單核細胞增多性乳桿菌。鼠傷寒沙門氏菌菌株VNP20009，奇異瘧原蟲和大腸桿菌從美國型別培養收藏中購買（分別為202165號，29906和23506）。

小鼠：從Taconic Biosciences購買的雌性BALB / c小鼠（4-6周齡）。

PS：所有動物實驗均獲得機構動物護理和使用委員會（IACUC；哥倫比亞大學，協議ACAAAN8002和AC-AAAZ4470）。所有人員都應接受培訓（包括但不限於健康檢查、對實驗動物和屏障設施的人道處理），並始終遵循批准的規程。生物安全2級細菌（包括本方案中使用的減毒鼠傷寒沙門氏菌菌株）的使用應得到IACUC的批准，符合環境健康和安全的機構指南，並在適當的專用空間進行。在進行動物實驗時，重要的是要注意小鼠性別的差異。這可能會影響結果，因此應予以披露。

試劑：RPMI 1640 （Gibco Thermo-Fisher， cat。 no。11835030）、DMEM F12 GlutaMAX supplement （Gibco； Thermo-Fisher， cat。 no。 11320033）、FBS （Gibco； Thermo-Fisher， cat。 no。10-437-028）、Penicillin-streptomycin （CellGro； Thermo-Fisher， cat。 no。 15-070-063）、LB broth （Lennox； Thermo-Fisher， cat。 no。 BP9722-500）、Kanamycin （Sigma-Aldrich， cat。 no。 10106801001）、Gentamicin （Thermo-Fisher， cat。 no。 15-750-060）、0。05% trypsin EDTA （Gibco； Thermo-Fisher， cat。 no。 25-300-054）、Hypoxia dye Image-IT hypoxia reagent （Thermo-Fisher， cat。 no。 H10498）、Dimethyl sulfoxide （Thermo-Fisher， cat。 no。 50-147-371）（避免吸入蒸氣或霧氣）、LB agar （Lennox； Thermo-Fisher， cat。 no。 22700025）、1× Dulbecco’s PBS （Thermo-Fisher， cat。 no。 14190144）、190 proof ethanol （Thermo-Fisher， cat。 no。 22-032-600）、Bleach （Clorox）（避免接觸面板、眼睛和衣服。每次使用後，請擰緊蓋子。）、N-（β-Ketocaproyl）-L-homoserine lactone （Sigma， cat。 no。 K3007）、Paraformaldehyde （PFA）， 4% （vol/vol） in PBS （Fisher Scientific， cat。 no。 AAJ61899AP）（避免接觸面板和眼睛。避免形成灰塵和氣溶膠。在形成灰塵的地方提供適當的排氣通風。遠離點火源。採取措施防止靜電荷積聚）。

裝置：

腫瘤細胞培養：T75 組織培養瓶、Serological stripettes、Serological pipette gun、Multi-channel pipette、移液器、移液器吸頭、細胞計數器載玻片、細胞計數器、15-ml 錐形瓶、50-ml 液體儲液罐、96-well透明圓底超低附著板、II類 A2生物安全櫃、37 °C CO2 培養箱、37 °C 水浴鍋、離心機、真空管路。細菌培養：12-ml培養管、II類 A2 生物安全櫃、37 °C恆溫搖床、NanoDrop OneC、塑膠比色皿、37 °C CO2 培養箱、培養皿。質粒/菌株：Constitutive sfGFP、N-（β-Ketocaproyl）-L-homoserine lactone （AHL）-inducible sfGFP、AHL-inducible therapeutics、Hypoxia-inducible asd、Lactate-inducible glms。成像基軟體：EVOS FL Auto 2 細胞成像系統、Celleste 成像分析軟體、Nikon TiE 顯微鏡、Nikon Elements 軟體、Image-J 或 FIJI、Graphpad Prism v。8。0。體內實驗：1ml注射器、異氟醚異硫化溶液、 壓縮氧氣、麻醉機、卡鉗、老鼠糧食、動物籠子。

試劑配製

細菌培養基：LB、50μg/ ml卡那黴素。腫瘤細胞培養基：RPMI 1640，含10%FBS和1%青黴素 - 鏈黴素。球狀腫瘤培養基：RPMI 1640，含10%FBS。共培養的培養基：RPMI 1640，含10%FBS和2。5μg/ ml慶大黴素。

步驟

腫瘤球體制備（表3）

解凍腫瘤細胞：略擴增腫瘤細胞：略種子腫瘤細胞球體：0。25×106/10ml腫瘤細胞取100微升，加入96孔板中，室溫下以100g，5分鐘離心。將96孔板轉移到培養箱中，每天觀察腫瘤球體形成情況。孵育球體4天。

表3。 建議腫瘤細胞培養條件

細菌與腫瘤球體共培養

將細菌新增到腫瘤球體中：球體播種4 天后，檢查腫瘤球體的外觀。在明場顯微鏡下，核心應比外圍看起來略暗，表明壞死中心形成。將細菌培養管以3000g， 5分鐘離心，收集細菌。2ml 1×DPBS重懸細菌，取1ml於比色皿中，檢測細菌光密度。如鼠傷寒沙門氏菌隔夜培養的OD600應該為~3。用1×DPBS將OD600調整為0。5（1ml溶液現在應含有〜0。1-0。2×109鼠傷寒沙門氏菌的c。f。u。）。取出含有腫瘤球體的96孔板，將2μl細菌溶液加入96孔板上的每個球體孔中，將96孔板轉移到培養箱並孵育2小時。去除腫瘤外細菌：孵育2小時後，取出共培養板並在明場顯微鏡下觀察。在腫瘤球體周圍的孔底部應看到小的細菌斑點。用p200的移液器和160μl 1×DPBS，反覆洗滌幾次。最終

使得96孔板只剩球體

。最後，緩慢加入200μl含有慶大黴素的共培養基。

細菌浸潤和定植

對腫瘤球體內的細菌進行成像：略缺氧和腫瘤球體影象：略使用c。f。u。跟蹤細菌生長：略製備組織學樣本：略

預期成果

本文設想BSCC系統將促進廣泛的實驗研究，包括細菌-癌症相互作用、遺傳回路動力學和高通量治療測試等。在腫瘤球體中初步建立細菌的腫瘤定植是關鍵步驟，也是許多下游研究的基礎。為了表徵細菌的入侵和生長，我們跟蹤了隨著時間的推移，鼠傷寒沙門氏菌ETH1301中表達的sfGFP熒光。在與腫瘤球體一起孵育後，最初觀察到細菌附著在球體表面，將慶大黴素加入培養基以後，細菌在腫瘤球體內部浸潤、定位和增殖（圖5a）。Typhymurium S。 typhymurium位於球體的壞死和缺氧區域，在體內重現細菌定植條件（圖5b）。細菌sfGFP和c。f。u。水平都增加了14天（圖5c-f）。

圖5。共培養體系中細菌和腫瘤球體的表徵

隨著時間的推移，維持穩定的共培養能力使該方案適用於細胞動力學的定量監測。我們表徵了基因迴路的動力學，包括腫瘤球體內的誘導，生物感測和邏輯閘構建。透過在培養基中新增誘導劑並透過延時顯微鏡監測動力學來測試小分子AHL誘導電路（圖6a–c）。這揭示了誘導時sfGFP訊號的增加，在腫瘤核心附近的約4小時達到最大表達（圖6de）。利用3D腫瘤模型提供的自然腫瘤環境，我們還測試了細菌感知腫瘤缺氧，乳酸和酸度的能力。將兩個生物感測器耦合到細菌生長，構建了一個AND邏輯閘系統，其中細菌只有在遇到兩個訊號時才允許增殖（圖6f）。透過與腫瘤球體共培養來測試細菌的效能，證明工程細菌能夠感知腫瘤球體中的環境並響應生長（圖6g）。

圖6。 腫瘤球體中的基因迴路效能

該共培養方案與標準的96孔相容，允許高通量藥物測試（圖7ab）。由於細菌的癌症治療研究通常只測試有限數量的治療有效載荷，並且通常不會並排比較，因此我們測試了可表達細胞毒性抗腫瘤有效載荷庫的細菌的功效。當細菌定植在CT26球狀體核心上時，我們誘導治療成分表達，隨後觀察到許多治療方法使得腫瘤球狀體生長下降（圖7c）。透過測量細菌表達的sfGFP來量化有效載荷表達對細菌的生長負擔（圖7d）。治療的球體的組織病理學分析（TUNEL染色）顯示治療後腫瘤球體內的腫瘤細胞死亡（圖7e）。為了便於對治療療效的機制理解，可以透過分別評估細菌c。f。u。，裂解物和熒光表達水平組合測試各種因素，例如細菌生長、載荷有效性和表達水平等。最後，我們透過使用同源CT26小鼠模型驗證了體內療效。與對照菌株相比，從體外篩選中確定有效的菌株在腫瘤生長中引起反應。對療效的線性迴歸分析揭示了其高度相關性（圖7f），證明了體外篩選平臺的預測能力。

圖7。治療篩查和驗證

全文連線：

https：//www。nature。com/articles/s41596-022-00723-5

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