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《科學》:14種Cre譜系追蹤揭示肝臟再生的細胞來源

肝臟是人體的一個重要器官,主要負責解毒、消化、蛋白合成和能量代謝等過程。人們很早就發現肝臟有驚人的再生能力,然而,究竟哪些細胞在肝臟的正常維持及損傷修復中發揮重要作用,卻一直存在爭議。從結構上看,肝臟由上千個稱為肝小葉(liver lobules)的重複單元構成。每個肝小葉的橫截面為蜂窩狀六邊形,六邊形中心為中央靜脈,頂點為三聯管構成的門管區。三聯管由小葉間靜脈,小葉間動脈及小葉間膽管組成。小葉間靜脈連線消化道,主要負責向肝運送各類營養物質。而小葉間動脈則負責從心臟向肝臟輸送氧氣。小葉間動脈及小葉間靜脈的血液叢門管區流入肝臟後,在小葉內一些稱為肝血竇的毛細血管中彙集並流入中央靜脈最後匯入下腔靜脈。肝血竇的周圍,充斥著大量肝細胞及少量的巨噬細胞及星狀細胞等。膽管負責收集由肝細胞合成並從肝細胞間隙流出的膽汁,最後匯入膽囊或者十二指腸。隨著血液的流動,營養物質和氧氣不斷被肝細胞吸收,於是形成了從門管區到中央靜脈區的梯度環境,這決定了對氧氣需要不等的代謝過程在小葉內部呈現不對稱分佈。因此,我們能觀察到肝小葉不同位置的肝細胞表達不同水平的代謝相關基因。根據代謝功能的不同,從門管區到中央靜脈,每個小葉大致可分成第一、第二和第三區域(zone 1, zone 2 and zone 3)。

十年來,關於三個區域的肝細胞是否具有相同的再生能力,還沒有定論。

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關於肝臟再生,Michael Karin研究組發現肝小葉第一區域少部分肝細胞能被Sox9標記的細胞,並在損傷修復中起重要作用【1】。而 Roel Nusse研究組發現,第三區域中央靜脈周圍有少量的Axin2陽性細胞, 在肝穩態維持中不斷分裂產生新細胞並向其它區域擴張【2】。但這一結果在不久前,受到了來自於Jan S。 Tchorz研究組的挑戰, 他們用細菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome)構建了一個新的Axin2-CreER 轉基因小鼠,該轉基因不破壞內源 Axin2 基因的表達, 結果顯示Axin2陽性細胞在穩態條件下,基本不擴增【3】。此外, Steven E。 Artandi 研究團隊發現,零星分佈於整個肝小葉的Tert高表達的細胞,無論在穩態還是在損傷修復中,都能夠大量擴增並覆蓋肝小葉的大部分割槽域【4】。最後,Holger Willenbring研究團隊用腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)隨機零星標記不同的細胞,發現肝小葉不存在增殖能力更強特殊細胞群,不同區域的肝細胞都有不同程度的增殖【5】。由於這些相互矛盾的結論是對不同的單一細胞標記的小鼠進行追蹤而得到,沒法排除其他未標記細胞是否也對肝再生有貢獻。加上實驗條件的不同,我們無法對這些結果進行比較分析並得出一個清晰結論(特別點評| 3篇Cell Stem Cell 劍指成體肝臟中或無特定標識的“幹細胞”群體)。

2021年2月26號,德克薩斯州立大學西南醫學中心兒童研究所

Hao Zhu

研究組在

Science

雜誌上發表了題為

Science

的研究文章(Research Article):

Liver homeostasis is maintained by midlobular zone 2 hepatocytes

《科學》:14種Cre譜系追蹤揭示肝臟再生的細胞來源

此前由於缺少能夠標記肝小葉不同細胞型別的工具鼠,人們很難全面評估肝臟不同細胞群的再生能力。Zhu研究組的研究人員

Liver homeostasis is maintained by midlobular zone 2 hepatocytes

該研究組還從Jackson Laboratory引入了3種已有的CreER小鼠,其中包括特異標記膽管上皮細胞的Krt19-CreER小鼠。接著,研究人員將這些小鼠與tdTomato熒光轉基因報告小鼠雜交,得到的子代小鼠用Tamoxifen啟用紅色熒光蛋白的表達,結果顯示:肝小葉的每個區域的肝細胞及膽管內皮細胞,至少能被兩種轉基因小滑鼠記。於是,

揭示了肝小葉第二區域(zone2)的肝細胞是肝臟穩態維持和損傷修復中的主要細胞來源。該研究不僅回答了肝臟的基本生物學問題,且有助於我們理解脂肪肝,酒精性肝損傷和肝癌等慢性肝疾病的病變過程。

,比較分析發現:在穩態條件下,小葉中心區域的肝細胞不斷分裂產生新的細胞,而第一區域和第三區域的部分細胞則逐漸消亡。為了排除該結果與小鼠轉基因有關,研究人員還用低劑量腺相關病毒(AAV)對少部分肝細胞進行隨機標記和追蹤,結果仍然支援肝小葉中心區域增殖更快的結論。進一步分析顯示:新生細胞並非來源於數目極少的幹細胞,而是來自於第二區域中的一組頻繁出現的成熟肝細胞。為了充分驗證這些結果,研究人利用能夠在DNA複製時候整合到基因組的胸腺核苷酸類似物EdU進行細胞測試,結果證實發生增殖的細胞更多位於小葉中心區域。另外,Zhu研究組還用模仿普通肝毒性的化學物質開展了肝損傷修復實驗,結果表明:第二區域的肝細胞能夠免受損傷並補充到小葉的其它受損區域。

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為了找到第二區域細胞擴增的主要調控機制。研究人員首先進行對整肝進行單細胞測序和分析,也從發表的文獻中挖掘資料【6】(Ben-Moshe et al。 2019),最終篩選到兩組肝小葉中心區域特異的基因:一組在中心區域富集,另一組在中心區域降低或缺失。接著,研究人員利用CRISPR-Cas9系統進行了一系列包括基因敲除或啟用的篩選實驗。最後分析發現,Ccnd1是中心小葉增殖的一個重要基因。有趣的是,免疫組化結果顯示,CCND1在肝小葉中心區域特異表達。接著,研究人員透過包括Western blot在內的實驗發現,IGFBP2透過啟用mTOR通路調節CCND1在小葉第二區域的表達,從而調控肝小葉中心區域細胞的增殖。在小鼠中抑制或者敲除IGFBP2-mTOR-CCND1通路的任一組分,都能夠有效抑制第二區域新生細胞的產生。

總之,

利用CRISPR-Cas9技術,將IRES-CreERT2整合到不同肝區域特異基因的3’-非翻譯區,從而構建了11種標記肝小葉不同區域的轉基因小鼠。

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該研究由西南醫學中心兒童研究所Hao Zhu研究組及其他合作者共同完成。韋永龍博士為本文的第一作者。西南醫學中心的兒科、內科副教授,西南醫學中心Kern Wildenthal, M。D。, Ph。D。 傑出教授,德克薩斯州癌症預防和研究所(CPRIT)的癌症專家Hao Zhu 博士為本文的通訊作者。

值得一提的是,同期

研究組以前所未有的規模同步追蹤這14群細胞在一年內不同時間點的增殖或消亡情況

雜誌還發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心(生物化學與細胞生物學研究所)

該研究發現了穩態情況下,增殖的肝細胞主要來源於肝小葉第二區域,這一過程受IGFBP2-mTOR-CCND1訊號通路的調控。這不僅回答了肝臟生物學中的一個基本問題,也為理解肝病的發生和發展提供了有益的參考。

研究組的研究成果(詳見BioArt今日頭條報道)

Science

。該研究

Science

周斌

雜誌還評論文章highlight了上述工作。

《科學》:14種Cre譜系追蹤揭示肝臟再生的細胞來源

《科學》:14種Cre譜系追蹤揭示肝臟再生的細胞來源

目前,Hao Zhu研究組正在招聘博後,有意者請郵件諮詢

Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair

Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair

首次開發了能夠長時程示蹤體內細胞增殖的新技術,利用該技術研究人員發現了成體肝細胞的來源,為肝臟再生及肝疾病臨床治療研究提供了新思路。

Science

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1。 Font-Burgada, J。, S。 Shalapour, S。 Ramaswamy, B。 Hsueh, D。 Rossell, A。 Umemura, K。 Taniguchi, H。 Nakagawa, M。 A。 Valasek, L。 Ye, J。 L。 Kopp, M。 Sander, H。 Carter, K。 Deisseroth, I。 M。 Verma and M。 Karin (2015)。 “Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer。” Cell 162(4): 766-779。

2。 Wang, B。, L。 Zhao, M。 Fish, C。 Y。 Logan and R。 Nusse (2015)。 “Self-renewing diploid Axin2(+) cells fuel homeostatic renewal of the liver。” Nature 524(7564): 180-185。

3。 Sun, T。, M。 Pikiolek, V。 Orsini, S。 Bergling, S。 Holwerda, L。 Morelli, P。 S。 Hoppe, L。 Planas-Paz, Y。 Yang, H。 Ruffner, T。 Bouwmeester, F。 Lohmann, L。 M。 Terracciano, G。 Roma, F。 Cong and J。 S。 Tchorz (2019)。 “AXIN2(+) Pericentral Hepatocytes Have Limited Contributions to Liver Homeostasis and Regeneration。” Cell Stem Cell。

4。 Lin, S。, E。 M。 Nascimento, C。 R。 Gajera, L。 Chen, P。 Neuhofer, A。 Garbuzov, S。 Wang and S。 E。 Artandi (2018)。 “Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury。” Nature 556(7700): 244-248。

5。 Chen, F。, R。 J。 Jimenez, K。 Sharma, H。 Y。 Luu, B。 Y。 Hsu, A。 Ravindranathan, B。 A。 Stohr and H。 Willenbring (2019)。 “Broad Distribution of Hepatocyte Proliferation in Liver Homeostasis and Regeneration。” Cell Stem Cell。

6。 Ben-Moshe, S。, Y。 Shapira, A。 E。 Moor, R。 Manco, T。 Veg, K。 Bahar Halpern and S。 Itzkovitz (2019)。 “Spatial sorting enables comprehensive characterization of liver zonation。” Nat Metab 1(9): 899-911。

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