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【摘要】

角膜內皮細胞（ HCECs） 是保證角膜透明的重要結構， 在角膜後彈力層和前房之間， 具有屏障和離子泵功能，防止前房房水進入角膜的同時又可以將角膜基質中的水分轉移至前房，維持角膜正常厚度。當 HCECs 損傷、密度下降到一定程度時，這種平衡被打破，就會產生角膜水腫等角膜疾病。因此，HCECs 在角膜組織解剖中的作用十分重要。此外，目前在體 HCECs 是不可再生的， 一旦損害，視力將會嚴重受損。本文中筆者就 HCECs 的正常生理、損傷機制、檢測、治療及再生的研究情況進行綜述。

【關鍵詞】

角膜內皮細胞； 損傷機制； 檢測； 治療； 再生

角膜內皮細胞（ human corneal endothelial cells， HCECs）是角膜中決定清晰視力的最重要結構， 一旦角膜內皮受損至一定程度，導致 HCECs 失代償， 就只能依靠手術治療。近年來，隨著國內外研究者對角膜內皮細胞的不斷深入研究， 有研究者試圖使 HCECs 在體內再次進入有絲分裂迴圈週期，使其再生，從而從根本上解決 HCECs 失代償問題。本文中筆者總結近年來相關研究的成果， 對 HCECs 的生理結構、損傷機制、相關疾病、致病因素、檢測、標記、染色方法、治療現狀及細胞再生的研究情況進行綜述。

一、HCECs 的正常生理狀態

人眼角膜是一種高度透明的組織結構， 從外到內有五層，分別是上皮細胞層、前彈力層、基質層、後彈力層及內皮細胞層［1］。HCECs 是角膜的最內層， 為單層細胞結構， 具有離子泵功能，與前房房水直接接觸， 在保持角膜透明方面起著重要作用［2］。HCECs 是由胚胎時期神經嵴細胞的間充質細胞 發 育 而 來 的， 出 生 2 個 月 嬰 兒 的 HCECs 密 度 由5624 個 /mm²到 1 歲 4252 個 /mm²， 後隨著角膜生長迅速下降，5 歲時約為 （ 3591 ± 399 ） 個 /mm²， 10 歲時約 （ 2697 ±246） 個 /mm²，然後再以每年 0．6% 的速度下降［3-6］。

二、角膜內皮損傷機制、相關疾病及致病因素

HCECs 需保持在 400 ～ 500 個 /mm²才能維持角膜的透明性和正常功能［7］。當疾病、年齡等因素造成 HCECs 損傷時，HCECs 會失去其屏障功能和離子泵作用， 引起角膜不可逆的水腫和混濁，造成患者不可逆的視力受損。由於 HCECs不可再生，只能依靠臨近細胞變大或者移行到達損傷區以維持屏障功能和離子泵作用。當 HCECs 損傷嚴重時， 臨近細胞的變大或者遷移不足以維持正常 HCECs 屏障功能和離子泵作用時，HCECs 就會失代償， 產生嚴重的角膜水腫和大泡性角膜病變，使視力下降。全身性因素、角膜原發病、屈光因素、青光眼、炎症和外傷均可導致 HCECs 損傷［8］。

全身性因素包括糖尿病、高血壓、代謝綜合徵及慢性腎衰［9-13］； 角膜原發病， 包括 Fuchs 角膜內皮營養不良、Peters 異常、虹膜角膜內皮綜合徵及圓錐角膜［14-18］。另外一些眼內手術， 如白內障手術、穿透性角膜移植手術、青光眼手術等均會造成 HCECs 的損傷［19-21］。青光眼手術會對 HCECs 造成一些 不 可 避 免 的 損 傷， 甚至引起HCECs 失代償； 玻璃體切除手術及矽油填充也可直接影響內皮細胞的形態［22-23］； 穿透性角膜移植手術是能有效提高患者視力的手術，但如果植片製作不當， 也會導致內皮細胞形態、密度及數量異常［24］。有報道碳酸酐酶抑制劑能夠造成角膜中央厚度顯著增加， 其原因可能是抑制了HCECs 的碳酸酐酶同工酶Ⅰ和Ⅱ，從而破壞了 HCECs 的離子泵功能， 造成角膜水腫［25］。

三、角膜內皮的檢測、標記和染色方法

HCECs 檢測最常用的方法是非接觸角膜內皮鏡（ 圖 1A）和活體共聚焦顯微鏡（ 圖 1B） ，可以評價角膜中央厚度、細胞面積的變異係數、平均細胞面積、六 邊 形 細 胞 比 率 以 及HCECs 的密度。角 膜 中 央 厚 度 可 間 接 反 應 HCECs 的 功能［26-27］。活體共聚焦顯微鏡可以對角膜進行從前往後的細胞水平的掃描和顯像，具有實時性、高解析度的優點［28］。同時可以使用自帶軟體對 HCECs 進行密度計算。細胞面積的變異係數可作為 HCECs 早期改變的敏感指標， 六邊形細胞比率對內皮細胞損傷和不穩定敏感性較高， 平均細胞面積和HCECs 密度可用來表示 HCECs 的儲備能力。另外眼反應分析儀、視覺化生物力學分析儀、Pentacam 三維眼前節分析儀、眼前節光學相干斷層掃描器、A 超和超聲生物顯微鏡等均可用來測量角膜厚度。

圖 1 非接觸角膜內皮鏡成像及活體共聚焦顯微鏡成像：圖A為角膜內皮鏡對角膜內皮評估介面； 圖B為活體共聚焦顯微鏡顯示角膜內皮細胞的大小、形態結構

Yoshihara 等［29］確 定 了 CLＲN1、MＲGPＲX3、HTＲ1D、GＲIP1 和 ZP4 共 5 個基因作為 HCECs 的新標記， 並透過獨立實驗在核糖核酸和蛋白水平上證實了這些基因的特異性。這些標記物可用於純化實際的 HCECs，也可用於評價其他細胞型別的產物。

內皮細胞可以用茜紅素-S 和臺盼藍進行離體組織染色［30-32］。操作時，沿角膜緣取下離體角膜， 依次置於 10% 甲醛溶液 15 min、新鮮檸檬汁15 min， 蒸餾水沖洗 3 次，10% 氯化金溶液 15 min、醋酸溶液（ 20 ℃ ） 15 ～ 16 h。取出角膜後，用齒鑷撕掉內皮層和後彈力層，再用顯微剪將角膜沿周邊向中央呈放射狀切開，顯微鏡下觀察［33］。

四、角膜內皮疾病的治療方法

( 一) 病因治療

由全身性因素引起的 HCECs 失代償， 應積極治療原發病，採取對症治療方式。如因為高血壓和糖尿病而查出內皮細胞失代償，應積極控制血壓和血糖； 腎衰竭應以透析為主；因屈光因素導致 HCECs 異常的佩戴角膜接觸鏡， 應儘量選擇透氧性高的鏡片； 因炎症性疾病導致的 HCECs 失代償， 應及時使用抗生素類藥物，必要時聯合糖皮質激素和非甾體消炎藥； 因藥物毒性引起 HCECs 損傷的， 應儘早停藥觀察； 眼科醫師在白內障、青光眼以及眼內手術時， 也應儘量避免損傷內皮細胞。

有研究者發現在白內障合併青光眼患者中， 將絲裂黴素 C應用於超聲乳化聯合小梁網切除術， 可減少術後併發症，降低損傷 HCECs 的風險［34］。

總之，角膜內皮疾病的患者，應仔細詢問既往史， 是否伴有全身其他疾病， 或者當發現患者 HCECs 密度處於持續下降狀態且其他治療均無效時，應囑患者去查全身相關其他疾病，排除全身因素造成的角膜內皮失代償。

( 二) 非手術治療

各種因素引起的角膜水腫， 角膜厚度增厚， 首選高滲脫水劑，上皮層不好的使用小牛血去蛋白提取物眼用凝膠等藥物，促進上皮癒合， 以及配合抗生素類藥物預防感染。角膜繃帶鏡也可保護角膜不受眼瞼摩擦損害， 促進上皮癒合， 減輕角膜水腫。當繼發青光眼時， 應當給予房水生成抑制劑，臨床早期可以透過降低眼壓來減輕角膜水腫， 減輕 HCECs負荷，對 HCECs 具有一定的保護作用。有報道稱視紫紅質蛋白激酶抑制劑 Y27632 可治療 Fuchs 角膜內皮營養不良引起的角膜水腫［35］。

( 三) 手術治療

手術是 HCECs 疾病最常見的治療方式。因 HCECs 再生困難，一旦受損或者密度下降，將是不可逆轉的， 作為角膜與房水之間的溝通橋樑，一旦受損，HCECs 離子泵功能受損， 角膜透明度下降， 角膜水腫， 則會引起屈光不正、視力下降、視物模糊。穿透性角膜移植術是過去最常見的手術方式， 現在角膜內皮移植術逐漸成為主流。角膜內皮移植術保留了角膜上皮層、前彈力層和基質層， 僅去除病變的角膜內皮層和後彈力層，術後併發症少，排斥反應輕， 該手術方式已取代傳統的穿透性角膜移植術， 具有恢復時間短、術後視力佳和免疫反應輕等優點［36］， 並可在原基礎上形成後彈力層撕除（ 自動） 角 膜 內 皮 移 植 術 ［descemet stripping （ automated ）endothelial keratoplasty，DS（ A） EK］ 和後彈力層角膜內皮移植術（ descemet membrane endothelial keratolasty，DMEK） 。

1． DSEK /DSAEK:

該手術方式是撕除角膜後彈力層和內皮細胞層，受體角膜保留至後基質層。DSEK 是植片保留少部分後基質層、後彈力層和內皮層； DSAEK 是使用角膜板層刀製作植片的技術。後來又有研究者將飛秒鐳射與 DESK聯合，使切割精度大大地提高，植片厚度也可控， 從而更安全有效，故稱之為飛秒鐳射 DSEK［37］。

2． DMEK:

DMEK 與 DSEK 區別是植片的製備方式不同，DMEK 只有角膜後彈力層和內皮層， 不含角膜基質層， 更符合角膜生理解剖功能，使植片與受體角膜在解剖結構上更加吻合，角膜後介面整齊， 與 DSEK 相比大大節省了供體植片的體積，並且降低了免疫排斥發生率［38-40］。DMEK 術後排斥率 ＜ 1% ，遠遠小於 DSEK，但其缺點是學習曲線較長， 並且對植片的要求相對較高，故該手術方式的應用並不廣泛［38］。

( 四) 細胞治療

1． HCECs 的體外培養和細胞前房注射治療： HCECs 在體內由於接觸抑制和轉化生長因子 β （ transforming growthfactor-β， TGF-β） 的影響， 不能進行有絲分裂， 理論上將體外培養的 HCECs 注入前房能治療因角膜內皮造成的角膜盲，但體外培養的 HCECs 仍存在內皮-間質轉化 （ endothelialmesenchymal transition，EMT） 等問題，TGF-β 阻滯、應用 L-抗壞血酸-2-磷酸生長基、抑制基質金屬蛋白酶活性等可以降低EMT［41］。有研究者向前房注射體外培養的 HCECs， 然後使患者保持俯臥姿勢可治療 HCECs 失代償疾病， 鐵磁感應與Y27632 可促進植片 HCECs 整合在受體 HCECs 中。但是， 此方法的遠期效果仍需進一步觀察［41］。

2． 組織工程療法： 作為治療角膜內皮疾病的一種替代療法，該治療方法包括種子細胞的篩選、載體選擇和 HCECs的移植。種子細胞要求能夠分化單層 HCECs，載體有殼聚糖和聚左旋乳酸等合成聚合物載體，也有明膠和角膜脫細胞材料等天然生物學載體。但是這兩種載體均有利弊， 聚合物載體純度高、各種化學成分均已知，但易引起術後炎症反應； 天然生物學載體中人脫細胞角膜基質材料是最佳選擇， 但缺點是供體有限。目前，已經有組織工程將 DSEK 植片成功植入動物眼角膜內皮層中［42］，但尚缺乏臨床驗證。

五、角膜內皮再生的研究現狀

( 一) 離體 HCECs 再生研究

HCECs 的分離先後經歷了機械刮削法、胰蛋白酶和中性蛋白酶法，但是由於這些方法容易引起 EMT， 使用的人越來越少，現在使用膠原酶分離 HCECs 已成為主流［43-47］。

有研究表明，HCECs 在體外具有有絲分裂能力， 在體內並未退出細胞週期迴圈， 但是細胞迴圈週期被抑制在 G1期［48］。最早角膜內皮有絲分裂的證據是由Treffers 發現的，兩名患者角膜中央因低溫造成損傷， 隨後進行了眼球摘除，該學者使用氚化胸苷發現了 HCECs 遷移和增殖的證據［49］。Joyce 和 Zhu 也發現［50］儘管 HCECs 在體內處於非增殖狀態，但它們仍具有再生能力，並可在體外繼續增殖。已有研究者證實在 兔 子 和 猴 子 角 膜 內 皮 體 外 培 養 的 培 養 基 中 加 入Y27632 能夠保持 HCECs 的增殖能力， 而可用於 HCECs 擴增的培養基有 DMEM（ dulbecco‘s modified eagle medium） 、SHEM（ supplemented epithel medium） 、Ham’ s F12/M199 和 OptiMEM-I （ reduced Serum Media is a modification of eagle‘ s minimum essential media）［51-53］。與上皮細胞相似， TGF-β 能有效抑制角膜上皮細胞增殖週期中G1 /S的轉變， 另外 TGF-β也是 EMT 重要訊號分子［54-57］。

Basu 等［58］發現角膜緣生物組織衍生的基質細胞在含有人血清的培養基中迅速擴增，具有高度克隆性。該團隊將體外培養的角膜緣生物組織衍生的基質細胞移植到小鼠角膜傷口時，角膜緣生物組織衍生的基質細胞有效阻止了含有纖維基質成分的光散射瘢痕組織的形成。角膜緣生物組織衍生的基質細胞的存在有效誘導了脫細胞間質再生， 再生的組織表現為片狀結構和膠原組織，且與原生組織無明顯區別。

周邊和中央的 HCECs 有著不同的增殖能力， 透過角膜內皮鏡對正常角膜中央、旁中央和周邊三個內皮層區域進行細胞形態學特點的比較， 同時進行對角膜內皮進行密度測量，發現 HCECs 在角膜中央的密度最小， 在周邊的密度最大［59］。神經生長因子是一種促進神經細胞生長和營養神經元的調節因子，另有研究者發現神經生長因子可以在體外培養的 HCECs 再生和修復，同時，成纖維生長因子是一種多肽生長因子，也可促進細胞增殖［60］。

有研究者發現使用 TGF-β 受體抑制劑和 /或 EMT 抑制因子能夠使 HCECs 在維持正常生理功能的情況下繼續生長［57］。Palchesko 等［61］研製了一種工程基底膜， 它是由一層緻密的Ⅳ型膠原和 /或層粘連蛋白組成，厚度大約為 510 nm，與Ⅰ型膠原膜連線，用此種工程基底膜設計一種 HCECs， 模擬具有薄基質層的後彈力層膜結構， 用於板層角膜移植。另有研究發現乙二胺四乙酸和膠原Ⅳ能夠解除細胞接觸抑制，促使 HCECs 再次進入增殖期，更好地維持 HCECs 的存活、分裂能力並維持其特性［45，62-63］。然而， 需要指出的是， HCECs體外培養技術雖已建立成功，但其體外細胞培養還存在增殖緩慢和不易儲存等侷限性，尚待解決。

( 二) 在體動物角膜內皮再生研究

早在 20 世紀 60 年代，Brunst 等［64］就曾研究過六角龍魚HCECs，該團隊分別使用 9000 r、6000 r、3000 r、1000 r、500 r及 250 r 的 X 射線 對 六 角 龍 魚 角 膜 進 行 照 射， 照射距離15 cm，結果顯示，使用 9000 r 照射後 8 d，角膜表面開始出現顆粒和色素細胞，15 d 後可見巨大的 HCECs，17 d 後數量更多，18 d 後成圓形，角膜成片狀， 裂解， 結構紊亂； 使用 6000 r照射後 18 d，HCECs 增大，21 d 後可見顯著增大，23 d 後可見色素細胞，30 d 後可見顆粒狀物質， HCECs 紊亂， 數量下降，大量色素顆粒； 使用 3000 r 照射後 17 d， 角膜水腫增厚，HCECs 增大，數量減少，21 d 後可見完全無序的 HCECs，35 dHCECs 逐漸消失， 在第 38 d 和第 42 d 發現消失的細胞被間質細胞替代； 使用 1000 r 照射 17 d 後， HCECs 被間質細胞替代； 使用 500 r 照射 27 ～ 28 d 後， 角膜損傷達到最大， 角膜不平整，HCECs 腫脹且仍可見，後有兩種不同結果，有些 HCECs完全恢復，55 d 後完全正常，有些在照射 62 d 後被間質細胞替代； 使用 250 r 照射 25 d 後， HCECs 增厚， 在第 49 d 和第62 d已能完全恢復正常。

Bredow 等［65］透過同種異體移植和同源移植兩種方法研究了大鼠角膜內皮再生的情況， 發現無論哪種移植， 移植的HCECs 都逐漸被宿主大鼠新生 HCECs 所重新填充。

Schwartzkopff 等［66］比較了 Fisher 和 Lewis 大鼠（ Ｒ 組） 異體移植後 HCECs 對內皮細胞丟失後的免疫反應， 以及 Lewis大鼠（ S 組） 同種異體移植後 HCECs 對內皮細胞丟失的免疫反應，結果發現 Ｒ 組發生了排斥反應， S 組 HCECs 丟失導致中等不透明改變，但是在接下來的幾周到幾個月裡， 兩組移植體的 HCECs 都恢復了清晰， 並且在原來的無 HCECs 移植體上出現了一層新形成的內皮細胞層， 其細胞不規則且增大。最後結論為大鼠在免疫或手術破壞 HCECs 後， 可恢復移植物的清晰度，HCECs 在大鼠角膜移植模型中再內皮化並進行增殖。

Bostan 等［32］選取了 16 只 健 康 的 貓 進 行 研 究。其中，8 只右眼行角膜中央內皮刮除； 4 只注入體外培養密度為 2 ×105個 /mm²的貓 HCECs 和 Y27632； 4 只 注 入 密 度 為 1 ×106個 /mm²的貓 HCECs 和 Y27632， 並進行內皮標記； 2 只內皮全刮除， 並注入 標 記 過 的 密 度 為 1 × 106個 /mm²的 貓HCECs 和 Y27632； 3 只中央內皮刮除和 3 只內皮全刮除的只注入 Y27632。結果發現中央內皮刮除的注入 2 ×105個 /mm²的貓角膜透明度和厚度最好， 最後得出結論， 注入體外培養HCECs 對內皮功能不全影響不大， 只注入 Y27632 可使貓HCECs 再生。

Cornell 等［67］研究牛 HCECs 在超順磁性氧化鐵奈米粒子磁場作用下的形態和生存能力的變化， 發現當超順磁性氧化鐵奈米粒子濃度為 100 ×106mol /L 時， 和無超順磁性氧化鐵奈米粒子相比，其代謝具有統計學差異， 但是骨架差異不具有統計學意義。

Okumura 等［52］對 7 只食蟹猴角膜進行冷凍損傷內皮細胞，造成 HCECs 損傷動物模型， 使用 Y27632 滴眼液， 發現在形態和功能上 Y27632 能夠有效促進內皮密度和內皮創傷的恢復。

Kielbowicz 等［68］實驗選用 25 只 10 ～ 12 個月大的貓， 依據觀察時間分為五組，將角膜後彈力層和內皮層細胞角膜碎片置於 Iscove 培養基中， 並加入 10% 胎牛血清， 將經體外繁殖後細胞增殖的細胞注入到貓的前房， 經 30 d 後 HCECs 完全恢復。

早在 1996 年，Nakahori 就發現兔 HCECs 具有增殖能力，也有人研究發現雖然綿羊 HCECs 在體內不能再生， 但是細胞培養研究表明它能在水凝膠膜上再生，水凝膠膜是 HCECs再生和移植的理想平臺［69-70］。Chen 等［30］發現， 兔 HCECs 癒合有不同的結果而取決於有無 Descemet’s 膜， Descemet‘s 膜對兔 HCECs 損傷後的再生起著決定性作用。

另外斑馬魚由於其有易於操作和顯著的再生能力， 且其角膜結構與角膜相似， 具有相似的發育基因表達庫， 包括轉化生長因子-β、角蛋白 3 和硫酸角蛋白， 其突變與人類角膜營養不良有關。Heur 等［71］使用 30 G 針頭將斑馬魚中央HCECs 刮除約 0． 785 mm²，並注入哇巴因抑制 Na+/K+酶活性，發現在 1 周後，斑馬魚內皮細胞恢復原來結構， 後來該團隊又用同樣的方法破壞斑馬魚內皮層細胞 0． 785 mm²， 不注入哇巴因，發現最早 1 d，斑馬魚 HCECs 層就恢復原有結構，最晚不超過 15 d。因此， 得出結論， 斑馬魚在內皮損傷 1 周後，就可重建內皮再生，恢復原有內皮層結構。

Kim 等［72］使用 20 G 彎針刮除 9 只紐西蘭大白兔內皮細胞層直徑約 7 mm 的後彈力層和 HCECs 層， 隨機分為三組，一組為對照組； 另一組植入體外培養的兔 HCECs、0% 天然蘆薈凝膠和絲素蛋白透明薄膜支架，第三組植入體外培養的兔HCECs、3% 天然蘆薈凝膠和絲素蛋白透明薄膜支架。結果發現天然蘆薈凝膠和絲素蛋白透明薄膜支架附著於角膜基質表面，並與周圍角膜組織融合，HCECs 恢復良好， 證明天然蘆薈凝膠和絲素蛋白透明薄膜支架有助於兔 HCECs 再生。

( 三) 角膜內皮再生的臨床研究

有研究者在動物實驗的基礎上，且在患者知情並簽署知情同意書的情況下， 將 Y27632 滴眼液應用於 8 名角膜混濁或全混濁的 HCECs 功能障礙的患者， 結果發現其能有效促進 HCECs 的癒合［52］。有研究者認為行後彈力層剝離術且無HCECs 替代的患者， HCECs 增殖可能是 HCECs 遷移和角膜基質深層自發重組的結果［73-74］。Pipparelli 等［75］研究指出Y27632 在體外和體內對 HCECs 均無毒性。Jullienne 等［76］透過建立 HCECs 損傷的數學模型預測了內皮功能的變化。結果顯示即使在長期 HCECs 損傷的 85 歲患者中， 計算得到該患者 HCECs 密度理論上應有 1592 個/mm²。實際結果為該患 者 在 第 5、8、16 和 22 個 月 HCECs 密 度 分 別 為549 個 /mm²、516 個 /mm²、987 個 /mm²和 1344 個 /mm²， 雖低於預測值， 但是證明了 HCECs 有一定的自愈能力。此外，Soh 等［77］還報道了首次成功用 Descemet＇s 膜移植治療 Fuchs角膜內皮營養不良的病例。

綜上所述，HCECs 對於人眼至關重要， 在維持角膜透明中起決定性作用。目前， 對於 HCECs 疾病的治療仍以手術為主， 對 HCECs 損 傷 患 者 的 早 期 發 現、早 期 幹 預、降 低HCECs 損傷還未獲得充分的重視。當前，角膜內皮移植手術已成為治療 HCECs 失代償的主要術式。值得指出的是， 雖然已證明 HCECs 在體外具有可再生能力， 並且有研究者發現在體內某種條件下 HCECs 可再次進入細胞週期， 但是目前對於 HCECs 增殖仍尚待明確、可以促進 HCECs 增殖的神經生長因子等的機制仍未明晰。是否可以找到一種合適的細胞能夠替代 HCECs， 一些再生的 HCECs 和正常的 HCECs是否有差異等諸多問題仍需明確。加之， 有關於 HCECs 再生的研究僅僅停留在體外培養或者動物實驗階段， 距離臨床應用仍有些差距。未來的研究重點應集中於應用組學技術從分子或基因水平揭曉 HCECs 增殖的機制， 再透過特定的方式增強 HCECs 增殖的潛能， 這樣才能為 HCECs 失代償患者帶來希望。

參考文獻

主體內容來源：中華眼科醫學雜誌