“深耕科技前沿動態，解讀科技背後真相，瞄準科技產品評測”
將 SIP-seq 應用於接受 ART 治療的個體。（a） 為了研究 ART 期間 HIV 的持續性，從血漿中檢測不到病毒載量的參與者身上抽取 CD4+ T 細胞樣本。（b） CD4+ T 細胞 DNA 樣本用 SIP-seq 處理以生成單個原病毒測序文庫。基因組 DNA （gDNA） 以液滴形式提取和劃分。DNA 在每個液滴中進行 MDA 擴增，然後進行 PCR 檢測和 HIV 陽性液滴的分選。來自每個分選液滴的 DNA 都經過條形碼化和測序。（c） 將序列資料對映到參考 HIV 基因組，以同時確定單個病毒基因組和整合位點 （IS）。
Credit：
Nature Biomedical Engineering
（2022）。 DOI： 10。1038/s41551-022-00864-8
人類免疫病毒 （HIV） 的感染，是透過將其基因組整合到受感染的細胞中，以進入一種逃避抗逆轉錄病毒治療的可逆潛伏期的非活動狀態。在單個細胞中對這種原病毒和相鄰宿主連線進行測序的能力，可以突出它們在受感染細胞中的作用機制和永續性。然而，由於人類 DNA 的數量要高出 1。5 億倍，這個實驗很難進行。在現在發表在
《自然生物醫學工程》上的一份新報告中
，Chen Sun 和加州大學舊金山分校、NIH 和美國 Chan Zuckerberg Biohub 的生物工程和病毒永續性和動力學研究的研究小組展示了全長前病毒如何與 HIV 宿主 DNA 連線透過高通量微流控分析，在原生環境中進行基於液滴的 HIV DNA 全基因組擴增。該團隊進行了聚合酶鏈式反應 （PCR），以標記含有前病毒的液滴，以對 HIV 感染者的感染細胞進行測序和分析，當時接受抑制性抗逆轉錄病毒治療，以檢測和測序配對的前病毒基因組和整合位點。這項工作旨在改善對持續感染 HIV 的細胞庫的遺傳分析。
HIV治療的現狀和不斷髮展的治療策略
雖然全世界約有 3700 萬人感染了人類免疫缺陷病毒（HIV），但治癒方法仍然未知。由於 HIV 將其基因組整合到受感染細胞的基因組中，病毒的感染機制構成了一個核心障礙，也是治癒該疾病的關鍵。雖然抗逆轉錄病毒療法 （ART） 可以將病毒複製抑制到無法檢測的水平並防止獲得性免疫缺陷綜合徵（AIDS） 的進展，但它缺乏針對細胞儲庫的活性。 因此，必須無限期地繼續治療以防止病毒反彈和疾病進展。由於終生抗逆轉錄病毒藥物管理的成本以及潛在的毒性，很難解決與艾滋病毒相關的汙名。因此，重要的是根除或抑制 HIV 感染的細胞宿主以獲得功能性治癒。為了檢查細胞庫的永續性，科學家必須對整合位點和全長原病毒序列進行配對分析。透過建立一種可靠且經濟高效地分離和測序稀有前病毒的方法，研究人員可以全面表徵 HIV 宿主。Sun 等人開發了這樣一種方法，使用同時整合位點和前病毒測序 （SIP-Seq） 來表徵 HIV 宿主內的前病毒及其細胞基因組環境。
用 HIV 感染的細胞系樣本演示和驗證 SIP-seq。（a） SIP-seq 使用針對 pol（綠色）和 env（紅色）基因的 TaqMan 分析來檢測含有 HIV 基因組的液滴。相比之下，巢式 PCR 擴增了近乎全長的 HIV 基因組，但不能同時恢復基因組和側翼宿主序列。相對於整合到人類基因組中的 HIV 基因組的示意圖顯示了引物結合位點。（b） SIP-seq 微流體用於識別 HIV 基因組序列，包括以下步驟。（i） 透過 MDA 封裝和擴增 DNA。等分試樣用 EvaGreen 染色以進行視覺化。（ii） 液滴合併用於新增 TaqMan PCR 試劑並進行液滴內 PCR。熒光影象顯示熱迴圈後的代表性液滴，表示將透過排序隔離的雙重陽性。（iii） 液滴分選用於選擇雙 PCR 陽性。顯示了 pol（FAM 染料）和 env（Cy5 染料）強度的代表性散點圖。對來自每個分選液滴的 DNA 進行處理以進行測序。比例尺，100 m。（c） SIP-seq 從兩個 J-Lat 細胞系的 DNA 混合物中概括了 HIV 病毒基因組和整合位點。來自細胞系混合物的 gDNA 用鳥槍法測序、巢狀 PCR 產物測序和包含兩個 J-Lat 前病毒序列之一的兩個 SIP-seq 液滴進行處理。兩種 J-Lat 前病毒都缺失 nef 基因和對映到全長 HXB2 基因組的序列，因此沒有讀取對映到該區域。餅圖表示從兩個細胞系的 50：50 DNA 混合物中恢復基因組。
Credit： Nature Biomedical Engineering （2022）。 DOI： 10。1038/s41551-022-00864-8。
戰勝困難：一種恢復單個原病毒基因組的方法
透過使用全基因組測序擴增，Sun 等人在微流體液滴內擴增了 HIV 基因組的原生環境，然後標記含有前病毒的液滴進行測序。由此產生的方法提供了一個全長病毒基因組，透過單個連續組裝連線到其宿主細胞連線處。該方法的速度和效率允許在1。5 億倍的 DNA 中恢復單個前病毒基因組。 該團隊使用 SIP-Seq（同時整合位點和原病毒測序）來分析各種 ART 相關個體的原病毒種群，以瞭解潛在的 HIV 病毒庫。雖然該團隊專注於 HIV，但這種方法適用於入侵宿主基因組的多種病毒，以提供一個通用平臺來表徵各種感染的遺傳學。
（a） ICE 是透過將參與者 CD4+ T 細胞接種到每 5 個孔中少於一個受感染的細胞並培養以進行克隆擴增來製備的。兩個 ICE 克隆被分別處理以使用不同的技術進行測序。（b） SIP-seq 檢測到整合到人類基因組中的完整 HIV 基因組。（c） SIP-seq 鑑定了一個整合的 HIV 基因組，該基因組包含一個反向序列和一個包含 3‘ LTR 的大缺失。使用基於 SIP-seq 結果設計的引物對未處理的基因組 DNA 進行巢狀 PCR，證實了 HIV 基因組（b 和 c 的底部面板）。
Credit： Nature Biomedical Engineering （2022）。 DOI： 10。1038/s41551-022-00864-8。
實驗
Sun 等人的目標是從數百萬CD4 + T 細胞群中恢復所有包含 HIV 基因組的 DNA 片段，對這些分子及其緊鄰的連線點進行單獨測序。該團隊從封裝在微滴中的細胞中提取大 DNA 片段，以分離整合的 HIV 基因組。使用多重置換放大（MDA），他們非特異性擴增每個基因組片段以獲得足夠的單個原病毒進行測序。然後，他們透過分離帶有 HIV 前病毒的單個液滴，對每個液滴進行條形碼和測序。然後，病毒學家將每個液滴的讀數對映到 HIV 參考基因組，以識別整合位點，以促進關於病毒基因組複雜性及其整合位點的清晰資訊——這對於評估細胞庫至關重要。
直接來自感染個體的 CD4+ 細胞的 HIV 前病毒和側翼序列的 SIP-seq。a，示意圖顯示了 TaqMan PCR 探針在 HIV pol 和 env 中的位置，以及用於近全長基因組擴增的巢狀 PCR 引物的位置。此處使用的排序僅基於 pol。b，來自具有ART抑制的個體（1和2）的T細胞的DNA的SIP-seq。系統發育樹是使用從每個參與者獲得的所有 HIV 序列中約 500 bp 的 pol 區域生成的。除非未鑑定出整合位點，否則指示了每個序列的宿主基因和相對於宿主基因的原病毒方向。每個條形代表單個 HIV 基因組及其整合位點的覆蓋圖。c，基因區域有利於整合位點，在 ART 抑制的參與者中發現了相對於宿主基因 （i） 的方向沒有偏好，並且發現了擴充套件的克隆 （ii）。d，來自沒有 ART 抑制的供體的 CD4+ T 細胞 DNA 的 SIP-seq（參與者 3 剛剛開始 ART，參與者 4 已暫停 ART）。e，參與者 3 和 4 中完整和有缺陷的 HIV （i） 和擴充套件克隆 （ii） 的百分比。Ψ，包裝訊號；MSD，主要剪接供體。
Credit： Nature Biomedical Engineering （2022）。 DOI： 10。1038/s41551-022-00864-8。
使用 SIP-Seq 檢測前病毒並調節微流體
為了增加全長前病毒的特異性並防止隨機 DNA 切割，Sun 等人採用了雙特異性多重 Taqman PCR，以針對 HIV 基因組上的區域。在實驗過程中，他們產生了特定體積的 DNA 來測序和確認 HIV 前病毒的恢復。SIP-Seq 設定的微流體包含三個裝置，包括液滴封裝器、合併器和分類器。科學家們用多重置換擴增 （MDA） 試劑載入人類基因組 DNA 片段，在 15 分鐘內將多達 100 億個長度約為 75 kbp 的 DNA 片段封裝在 2000 萬個單獨的液滴中。每個液滴包含 500 個不同的片段，Sun 等人在與 Taqman PCR 試劑合併之前，將它們在 30 攝氏度下孵育，以進行非特異性擴增。在對所有檢測到的 HIV 基因組重複這些步驟後，研究小組準備了用於測序的試管。
用於：a）將DNA和MDA試劑封裝成孤立的液滴；b）將MDA液滴與PCR混合液滴合併；c）對單個PCR陽性液滴進行排序。
Credit： Nature Biomedical Engineering （2022）。 DOI： 10。1038/s41551-022-00864-8
分析 ART 治療者的 HIV 前病毒及其基因組圖譜
Sun 等人接下來驗證了 HIV 細胞系的 SIP-Seq，並分析了接受 ART 治療的人的 HIV。在實驗過程中，他們透過鋪板製備細胞，讓接受過 ART 治療的人的 CD4 + T 細胞靜置，然後透過三種方法進行刺激和體外培養增殖；鳥槍法、巢狀 PCR和帶有 Taqman 探針的 SIP-Seq。SIP-Seq 和巢狀 PCR 均產生了出色的結果，該團隊特別選擇 SIP-Seq 來表徵體內感染細胞的完整遺傳多樣性。他們透過描述 HIV 前病毒的基因組景觀來跟蹤這項工作，他們直接從感染者的 CD4+ T 細胞中分離出來。結果揭示了三個克隆譜系支援克隆起源相對於以前對同一個人的研究。
研究表明
該研究表明，這些方法如何使 Chen Sun 及其同事能夠比現有的 PCR 方法更有效地研究 HIV 前病毒。結果透過表徵潛伏庫以突出其在 HIV 永續性中的作用，對體內 HIV 遺傳景觀進行了全面分析。由於稀有且缺乏不同的表面標記來識別潛伏感染的細胞，現有方法具有挑戰性。使用所描述的 SIP-Seq（同時整合位點和前病毒測序）方法，Sun 等人提供了一種快速、經濟高效且可擴充套件的過程，他們將其應用於接受抗逆轉錄病毒治療的人（ART），以突出克隆擴增細胞的潛在儲庫中的存在。該策略適用於 HIV 感染，也適用於在其生命週期中具有綜合狀態的其他病毒性疾病。
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