作者 | 夏巍
單位 | 荊州市中心醫院醫學檢驗部
案例經過
患者，男，66歲，農民，因“間斷頭痛1月，加重2天”於2021年3月9日入院。
該患者1月前患者無明顯誘因出現頭痛，伴有噁心未吐，無發熱感冒，無視物模糊，無四肢肢體抽搐無力，無咳嗽、咳痰，無腹痛、腹瀉等不適，於當地醫院住院予“抗病毒、止痛”等對症治療，患者頭痛有所好轉。
入院前一天患者頭痛再次發作，為求進一步診治，門診以“頭痛待查”收住我院。有高血壓病史，否認糖尿病、結核、癲癇病史，否認手術外傷史，否認藥敏史。
入院查體顯示：T 36。4℃，P72次/分，R19次/分，BP177/98mHg，神志清楚，雙側瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，四肢肌力肌張力正常，腱反射對稱存在，雙側針刺覺對稱，雙下肢病理反射徵未引出。
頸項強直4橫指，克氏徵陽性。腦影像學檢查：腦MR平掃+增強提示雙側小腦半球多發軟腦膜異常強化灶，初步診斷腦膜炎。
入院當天實驗室檢查結果示：中性粒細胞數：6。36×109/L，中性粒細胞百分率：90。6%，淋巴細胞數：0。4×109/L，降鈣素原：0。1ng/mL，CA72-4：9。78U/mL，FERRITI：435。85ng/mL，凝血功能及常規輸血全套結果均無異常。
入院第二天因患者病情需要，在徵得患者及家屬同意後，管床醫生為患者行腰穿獲取無色澄清透明腦壓為330毫米水柱的腦脊液。
案例分析
初步分析：該患者存在頭疼症狀且腦膜刺激症呈陽性反應，結合其影像學表現，臨床初步診斷為腦膜炎。那麼，該患者是感染性還是非感染性腦膜炎呢？
非感染性腦膜炎常見病因：
1。腦血管意外：該病亦可出現四肢抽搐、意識喪失等症狀，但該病多既往有心腦血管及糖尿病等基礎疾病，且該患者無外傷史，暫不考慮；
2。蛛網膜下腔出血：可出現劇烈頭痛，但該患者腦脊液無色澄清透明，而蛛網膜下腔出血後腦脊液黃色或紅色加以鑑別，且門診資料顯示該患者頭MR未見出血，綜上所述該患者感染性腦膜炎可能性較大；而感染性腦膜炎常由細菌、病毒、真菌和寄生蟲等所致。我們進一步分析該患者腦脊液相關檢查如下圖所示。
圖1 腦脊液常規檢查
圖2 腦脊液細胞學檢查
圖3 腦脊液生化檢查
根據《臨床檢驗基礎》［1］教材中對常見腦膜疾病的腦脊液檢驗鑑別見表1，結合該患者腦脊液檢驗結果（圖1至圖3）我們綜合分析：
首先該患者腦脊液理學檢查結果為無色透明且無凝塊，初步排除化膿性腦膜炎、結核性腦膜炎、腦出血、蛛網膜下腔出血等腦膜疾病；
其次患者腦脊液氯化物下降，腦脊液蛋白增多，腦脊液葡萄糖正常且結合細胞學檢查發現細胞總數增多以淋巴細胞明顯增加為主，中性粒細胞僅佔約3%，我們進一步排除病毒性腦膜炎、流行性乙腦、腦腫瘤腦膿腫、神經性梅毒。
此時，我們高度懷疑該患者存在隱球菌性腦膜炎的可能性較大。隨即聯絡該患者的主治醫師開隱球菌相關檢測專案。
隱球菌性腦膜是由隱球菌感染腦膜或腦實質引起的中樞神經系統感染性疾病，是中樞神經系統最常見的機會性真菌感染，好發於細胞免疫功能低下者，如AIDS、惡性腫瘤、糖尿病、器官移植及大劑量使用糖皮質激素者［2］。
近年來，由於廣譜抗菌藥物、糖皮質激素、化療藥物、免疫抑制藥物的廣泛應用及免疫缺陷性疾病和器官移植的增加，隱球菌性腦膜炎增長率大幅上升，顯著高於病毒性腦膜炎和結核性腦膜炎［3］。
隱球菌是酵母類真菌，廣泛存在於自然界中，也可存在於人體面板，口腔及腸道中。引起人類感染的隱球菌主要是新型隱球菌和格特隱球菌，新型隱球菌和格特隱球菌常統稱為新型/格特隱球菌複合（Cryptococcus gattii/neoformans species complexes）。
根據傳統分型，新型隱球菌包括3個變種，即新型隱球菌格魯比變種（血清型A型，Cryptococcus neoformans variety Grubii）、新型隱球菌新生變種（血清型D型，Cryptococcus neoformans variety neoformans ） 和新型隱球菌混合變種（血清型AD型，Cryptococcus neoformans AD hybrid）。
由於隱球菌性腦膜炎臨床表現及影像學檢查多無特異性，其診斷主要依賴於實驗室檢查。常用的實驗室診斷方法包括腦脊液顯微鏡下直接檢測、真菌培養、莢膜抗原檢測及分子生物學檢測［4］。
表1
1.墨汁染色法及莢膜抗原檢測
微生物學組收到腦脊液標本。外觀：無色透明。首先將腦脊液標本離心處理後收集沉澱，並進行墨汁染色後進行鏡下檢測。印度墨汁塗片直接鏡檢：可見圓形或卵圓形的有折光性菌體，其周圍有一圈透亮的厚莢膜，內有反光孢子，基本確定為隱球菌。見圖4。與此同時，用該患者血清加做莢膜抗原檢測，結果該患者血清莢膜抗原為陽性。見圖5。
圖4墨汁染色
圖5 莢膜抗原檢測
2. 分離培養與鑑定
隨後我們為了進一步鑑定，我們將腦脊液標本接種在沙氏培養基上，利用病原性隱球菌在25℃和37℃孵育均可生長，而非病原性隱球菌在37℃時不生長特性［2］。我們將接種好的培養基放入37℃培養箱裡，48h後觀察菌落是否生長。
經過37℃48h培養，沙氏平板上可見生長茂密、呈奶油色、蠟樣光滑，粘稠的酵母樣菌落［3］，見圖6。
圖6 分離培養
這裡我們為了大大縮短鑑定時間及能很好地區分隱球菌不同血清型和分子型，我們用基質輔助鐳射解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）進行鑑定。最終結果為新型隱球菌格魯比變種（血清型A型，Cryptococcusneoformans varietyGrubii），分值1。986分。結果及峰圖分別見圖7和圖8。
圖7
圖8
3.藥敏實驗
參照酵母菌肉湯稀釋法藥敏試驗標準用基於微量肉湯稀釋法ATBFungus 真菌藥敏試條進行藥敏實驗結果如下：5-氟胞嘧啶（5-FC）、氟康唑（FCA）、兩性黴素B（AMB） 均敏感。
總 結
新型隱球菌廣泛分佈於自然界，以出芽的方式生殖，免疫低下的人群更易被感染。治療時間長，其致死率、致殘率較高，因此早期、精準診斷顯得尤為重要。
早期主要依靠臨床醫師的高度警惕，懷疑出現腦病時應及時行腦脊液檢查，目前實驗室可以透過傳統病原學檢測手段包括墨汁染色、真菌培養、莢膜抗原檢測以及分子生物學方法包括PCR、質譜分析法、宏基因組下一代測序等技術，聯合應用可提高隱球菌的檢出率。
作為檢驗工作者的我們除應具備專業技能，還應該多多主動與臨床溝通，以及時找到病因使患者得到有效的治療。
［參考文獻］
［1］劉成玉，羅春麗。臨床檢驗基礎。第5版［M］。人民衛生出版社，2012。
［2］倪語星，尚紅。臨床微生物學檢驗。第5版［M］。人民衛生出版社，2013。
［3］王建中。臨床檢驗診斷學圖譜［M］。人民衛生出版社，2012。
［4］邢小微，張家堂。隱球菌性腦膜炎的診斷進展［J］。中國真菌學雜誌，2020，v。15（06）：63-65。
［5］李豔冰，魯炳懷。隱球菌病的實驗室檢測與臨床研究進展［J］。華西醫學，2020（8）：894-900。
END
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編輯：徐少卿 審校：陳雪禮