編者按：

肺癌是當今世界嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，分子技術和精準靶向藥物大大改變了晚期NSCLC的治療格局。肺癌的靶向治療離不開肺癌的分子靶點檢測，分子檢測涉及到各個方面，任何一個因素都可能影響分子檢測結果準確性。為了規範肺癌的分子檢測，AZ聯合國內相關專家對肺癌分子檢測的樣本要求、技術平臺、檢測內容與規範和檢測觀念進行全面闡述。本期91360智慧病理網邀請廣東省肺癌研究所張緒超教授先簡要介紹近些年來最新NSCLC中基因靶向藥物進展，然後重點闡述NSCLC中靶向藥物相關基因的檢測方法及其優缺點，探討基因檢測的策略。

張緒超教授

博士，博士生導師。廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）醫學研究中心主任、華南理工大學第一臨床學院廣東省肺癌研究所研究員、廣東省肺癌轉化醫學重點實驗室副主任、2018廣東省傑出青年醫學人才、兼任中國臨床腫瘤學會（CSCO）理事會常務理事、CSCO腫瘤生物標誌物專家委員會秘書、廣東省轉化醫學會腫瘤學分會主任委員、廣東省抗癌協會肺癌專業委員會常委、廣東省抗癌協會靶向治療專業委員會副主任委員、廣東省抗癌協會分子診斷委員會候任主任委員、廣東省藥理學會腫瘤藥理專業委員會副主任委員、美國臨床腫瘤學會（ASCO）會員、美國癌症研究協會（AACR）會員、歐洲腫瘤內科學會（ESMO）會員、國際肺癌研究協會（IASLC）會員。

研究方向為腫瘤的分子標誌物與轉化應用研究，主要涉及癌症預測預後分子標誌物、腫瘤的細胞與分子異質性、腫瘤免疫微環境、癌症轉移機制、腫瘤遺傳變異檢測技術等。著重在腫瘤的臨床分子靶點和相關訊號通路分析及腫瘤進化和耐藥機制方面開展研究。獲得國家自然科學基金2項，省部級科研基金多項。參與“863”課題、衛計委行業專項及國家自然科學基金多項。

參與獲得國家科技進步獎二等獎1項、中華醫學會醫學科技一等獎1項、廣東省科技成果獎3項。在Science增刊發表綜述，在Nature Communications、Journal of Clinical Oncology、Annual of Oncology、Clinical Cancer Research、Journal of Thoracic Oncology、Molecular Cancer等雜誌以共同第一作者、第一作者或參與作者發表SCI文章五十餘篇。作為主要完成人獲得國家發明專利2項。主要參與制定CSCO 肺癌主要驅動基因EGFR、ALK、臨床NGS技術應用等檢測共識制定。研究論文獲得“CSCO中國肺癌學術翹楚獎”、中華醫學會呼吸病分會“高影響力呼吸學術論文獎”。

肺癌靶向治療新進展及相關基因檢測

隨著對NSCLC驅動基因的研究不斷深入，針對這些驅動基因改變的靶向藥物陸續被研發並在臨床進行相關的研究試驗。臨床試驗顯示針對這些驅動基因的靶向藥物展現出令人滿意或振奮的治療效果。下面我們就2021WCLC和ESMO會議上報道的一些新的靶向藥物研究新進展情況進行簡要介紹，並對這些驅動基因的檢測方法進行概括。

1

NSCLC中分子靶向藥物

《非小細胞肺癌分子病理檢測臨床實踐指南》（2021版）（下稱《指南 》）指出，NSCLC除了常見的EGFR、KRAS、ALK等基因，還有一些少見變異基因如ROS1、MET、HER2、BRAF、RET等，以及罕見基因變異如NTRK、NRG1/2和FGFR2等［1］。針對上述基因變異的靶向藥物近些年研發也取得了很大的成績。

除了諸多已經廣泛應用於臨床的藥物外，一批新藥也隨著臨床研究的進展得以獲批。CodeBreak 100研究中證實了索托拉西布對KRAS G12C突變NSCLC有效，掀起了對KRAS藥物研發的熱潮。RAF/MEK抑制劑VS-6766對KRAS突變尤其是G12V突變的肺癌具有初步顯效。近兩年成功出現的靶點中，RET是代表性靶點。依託LIBETTO研究和ARROW研究，selpercatinib（塞爾帕替尼）和pralsetinib（普拉替尼）先後獲批，開啟了RET肺癌的靶向治療大門。此外，國內外已上市多款用於MET 14外顯子跳讀突變NSCLC患者的MET抑制劑，如賽沃替尼（Savolitinib）、卡馬替尼（Capmatinib）、特普替尼（Tepmetko， Tepotinib）等。隨著EGFR/MET雙抗amivantamab（JNJ6372）在20ins的獲批，EGFR 20ins成為了獨立於EGFR常見突變（19和21外顯子突變）之外的“新靶點“，有著自己的藥物發展譜。常見的是amivantamab、Mobecetinib（TAK788）、波奇替尼。NSCLC中HER2基因變異主要分為基因擴增和基因突變，後者主要為外顯子20插入突變。針對HER2變異的藥物先後有阿法替尼、達克替尼、吡咯替尼、TAK-788、T-DM1等。NTRK作為肺癌新興靶向和罕見靶點，中國一項研究發現NTRK突變率為0。19%，其中NTRK1為0。11%，NTRK2為0。02%，NTRK3為 0。06%。目前針對NTRK基因變異的靶向藥物有拉羅替尼（LOXO-101）、LOXO-195和Entrectinib（RXDX-101）。

2

NSCLC靶向藥物相關基因異常型別

《指南 》中對NSCLC藥物相關靶點基因也進行了彙總，NSCLC中靶向藥物相關基因變異主要有以下幾種型別，其檢測級別也有伴隨診斷及補充診斷等不同。

目前，最常見的肺癌分子亞型有：

1.EGFR基因變異型別：

EGFR基因變異包括基因突變（點突變、插入/缺失突變），主要發生在編碼EGFR酪氨酸激酶區的第18~21號外顯子，以及獲得性耐藥突變（包括第一、二代TKI 的耐藥突變T790M 和第三代TKI 的耐藥突變C797S 等）。EGFR 基因擴增對選擇TKI 治療目前無明確臨床意義。

2. ALK基因變異型別：

ALK基因變異型別包括基因重排/融合，以及獲得性耐藥突變（點突變為主）。目前至少發現了20 多種EML4‑ALK 融合變異亞型。此外還有更多少見/罕見的ALK融合伴侶不斷被發現。

3. ROS1 基因變異型別：

ROS1 基因變異包括ROS1基因重排。目前共發現十餘種ROS1基因融合伴侶，主要包括CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR等，其斷裂位點主要位於ROS1基因的第32~36號外顯子。

4.MET 基因變異型別：

在NSCLC 的臨床實踐中，根據已有的循證醫學證據，目前主要關注MET第14號外顯子跳躍突變和MET擴增的檢測。

5. 除此以外，HER2、BRAF、KRAS、RET、NTRK等：

除了上述靶分子外，HER2基因突變或擴增、BRAF突變、KRAS突變、RET基因重排、NTRK家族基因重排等，均為NSCLC中重要的驅動基因變異，並是潛在的治療靶點。

6. PD‑L1表達檢測：

透過IHC檢測腫瘤細胞和/或免疫細胞PD‑L1的表達水平是目前判斷NSCLC患者能否從免疫檢查點抑制劑治療中得到更多獲益的主要評估手段。

3

肺癌相關基因檢測方法

肺癌靶向治療主要依賴於驅動基因靶點的準確診斷。NCCN指南推薦晚期NSCLC患者需要進行EGFR、ALK、ROS1、RET、MET、HER2、BRAF、NTRK、PD-L1等9個基因檢測。

針對上述NSCLC 中基因變異檢測，常見的分子病理檢測方法包括Sanger測序、FISH、qRT‑PCR、IHC、二代測序技術等。而《指南》［1］中對於不同的靶基因也給出了相應的檢測方法及解決策略：

（1）

EGFR基因突變常用檢測方法：

目前EGFR基因突變臨床常用的檢測方法包括Sanger測序法、qRT‑PCR法和二代測序等。主要包括EGFR最主要的突變位點外顯子19缺失（19del）和外顯子21點突變（L858R），同時還包括外顯子18點突變（G719X），外顯子20插入突變（20ins）和點突變（T790M、S768I），外顯子21 點突變（L861Q）等。Sanger 測序法是直接可檢測已知和未知突變的一種方法，是早期廣泛應用的EGFR 基因突變檢測方法。但Sanger 測序法檢測EGFR基因突變的靈敏度較低，操作步驟複雜、容易產生汙染，已不能完全滿足臨床EGFR基因突變檢測的需求。基於qRT‑PCR 的方法，需要根據EGFR基因已知的突變型別設計引物探針，無法檢測出所有可能的突變，但靈敏度相對較高，操作簡單，無需對PCR產物進行操作，在很大程度上避免了擴增產物的汙染，易於在臨床開展，是目前EGFR 基因突變檢測最常用的檢測技術之一。二代測序是一種高通量測序技術，能夠同時對多基因、多位點進行測序。二代測序檢測EGFR基因突變，檢測位點更加全面，可以發現罕見突變位點，為晚期NSCLC患者的全流程管理提供依據。

（2）

ALK 基因變異常用檢測方法：

ALK 基因重排導致ALK 融合基因的表達，可以用FISH、 qRT‑PCR 、IHC以及二代測序等方法檢測。ALK Ventana D5F3 IHC檢測方法是目前最快速、經濟的方法。該判讀標準僅適用於肺腺癌，該檢測在用於鱗癌、神經內分泌癌等其他型別肺癌標本時應謹慎，疑似陽性標本需要使用其他方法進行驗證。FISH檢測是檢測ALK重排的“金標準”，檢測結果判讀直觀，對樣本質量要求較低，但費用較高、經濟效益比不佳。並且在FISH判讀時，對於處於臨界值分離訊號、不典型分離訊號等的判定需要格外謹慎，推薦利用其他技術平臺複核檢測。基於qRT‑PCR方法的ALK融合基因檢測具有較高的靈敏度和特異度，但因為qRT‑PCR 只能檢測已知ALK 融合基因型別，所以存在假陰性。另外，由於qRT‑PCR基於mRNA擴增技術，因此實驗室內、外部質控等應制定最嚴格的技術標準，防止汙染。二代測序對ALK基因融合透過捕獲平臺在DNA/RNA水平或擴增子平臺在RNA水平上進行檢測。但對於質控不合格或結果不典型病例，報告時應加備註，並建議使用其他技術平臺進行復檢。同時當二代測序在血液中檢出ALK基因變異時，應注意假陰性結果的出現。

（3）

ROS1基因檢測方法：

ROS1基因重排/融合表達檢測各種方法學與ALK 相似，但IHC 抗體特異性不佳，目前不能直接用於檢測ROS1基因重排/融合表達，僅可用於ROS1基因融合初篩。基於qRT‑PCR方法的ROS1融合基因檢測具有較高的靈敏度和特異度，且可與ALK聯檢。FISH檢測是檢測ROS1重排的“金標準”。二代測序檢測ROS1基因變異同樣可在DNA水平上檢測重排序列，也可在mRNA水平檢測融合序列，但由於ROS1基因序列的特殊性，基於DNA水平的二代測序檢測靈敏度受文庫探針設計及生物資訊學分析能力影響較大，應注意假陰性。

（4）

PD‑L1表達檢測：

透過IHC檢測腫瘤細胞和/或免疫細胞PD‑L1的表達水平是目前判斷NSCLC患者能否從免疫檢查點抑制劑治療中得到更多獲益的主要評估手段。目前我國已批准3種標準化的PD‑L1檢測商用試劑盒用於臨床檢測，包括配套Dako平臺的PD‑L1 IHC 22C3 pharmDx試劑盒及濃縮液、PD‑L1 IHC 28‑8 pharmDx 試劑盒以及配套Ventana檢測平臺SP263試劑盒。不同單抗和IHC染色平臺的使用、PD‑L1染色陽性截斷值的設定與相應的免疫治療藥物療效相關。PD‑L1 檢測所用抗體克隆不同其陽性閾值不同。

（5）

MET基因變異的常用檢測方法：

MET第14號外顯子跳躍突變的檢測，包括二代測序或qRT‑PCR直接檢測缺失MET第14號外顯子的mRNA，或二代測序在DNA 水平上檢測可能導致MET第14號外顯子剪下的基因變異。MET 基因探針覆蓋範圍不夠可能導致基於DNA的二代測序發生漏檢，建議二代測序檢測應儘量涵蓋第14號外顯子外的如第13或14號內含子上可能發生剪下變異的區域。原位雜交檢測是檢測MET擴增的標準方法。相較於FISH，二代測序可用於MET擴增檢測，但與FISH檢測的對應性比較複雜，並可能遺漏MET多體，但是二代測序可同時檢測MET突變和融合等其他變異，且能實現多基因共檢，在臨床實踐中應用更廣。高水平MET擴增在NCCN指南中被納入作為靶向藥物的適應證。目前有趨勢顯示平均腫瘤細胞內的MET複製數（GCN）可能是個較好的指標，這個指標兼顧了病灶中腫瘤細胞比例及生物技術的分析能力，結果解釋簡單容易被臨床醫生理解，適合於臨床應用。

除了上述靶分子外，HER2基因突變或擴增、BRAF突變、KRAS 突變、RET 基因重排、NTRK 家族基因重排等的檢測方法可參照基因點突變、基因重排型別的檢測方法和檢測策略，更多的尚需臨床實踐的積累。

參考文獻：

1。 中華醫學會病理學分會， 國家病理質量控制與指導中心， 中華醫學會腫瘤學分會肺癌學組，等。 非小細胞肺癌分子病理檢測臨床實踐指南（2021版）。 中華病理學雜誌， 2021， 50（4）： 323-332。

宣告：

僅供醫療專業人士參考；

本文的採訪/撰稿/釋出由阿斯利康提供支援。

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