圖源：sciencenews

病毒載體在製造細胞療法過程中扮演著重要的角色，以 CAR-T 細胞為例，需要利用病毒載體將表達 CAR 的基因片段插入到T細胞中。不過，病毒載體價格昂貴，對生產、製造以及供應都有較高的要求，一定程度上限制了細胞療法的大量生產。

近日，加州大學舊金山分校（UCSF）的研究人員開發出了一種基於 CRISPR/Cas9 系統生產大量治療性細胞療法的新方法。這種新方法無需病毒載體即可幫助科學家高效將超長片段 DNA 序列（especially long DNA）精確插入細胞基因組中，而常規的方法都需要使用病毒載體將 DNA 遞送到細胞中。

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具體來說，在研究中，研究團隊將 Cas9 靶序列新增到單鏈 DNA 中，利用非病毒載體方式插入長 DNA 片段，並篩選一系列小分子化合物進一步促進同源定向修復，顯著提高人類原代 T 細胞和其他造血細胞型別的非病毒敲入效率和產量。

團隊指出，這種新方法為非病毒載體 CAR-T 細胞製造提供了一種良好的工藝流程，基因敲入效率達到 46% - 62%，一次操作可獲得超10 億個細胞（超 1。5 × 10^9）。這一產量已遠高於治療患者所需的細胞數量。

“多年來，我們的一大目標就是在不依賴病毒載體的前提下，將長片段的 DNA 序列精準插入基因組中的目標位點。我們現在提出的升級方法朝著開發出‘下一代’更安全有效的細胞療法邁出了一大步。”本文的通訊作者

Alex Marson

博士說。

▲圖|左為 Brian R。 Shy 博士，右為 Alex Marson 博士

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Alex Marson

是格萊斯頓-加州大學舊金山分校（UCSF）基因組免疫學所主任，他實驗室的研究方向是利用新型的 CRISPR 基因組工程技術理解調控免疫細胞功能的基因迴路，尤其是 T 細胞。他與同事已經開發出了基於 CRISPR 可高效編輯人免疫細胞基因組的新工具，並將其應用於增強“下一代”細胞免疫療法。

本文第一作者兼共同通訊作者

Brian R。 Shy

博士是

Alex Marson

實驗室的臨床研究員，他的研究方向是基因組編輯工具的治療應用，重點是基於非病毒載體 CRISPR/Cas9 方法的臨床轉化工作。

編輯效率提高超 1 倍，一次操作可生產超 10 億個 CAR-T 細胞

多年來，

Alex Marson

實驗室的一個重點研究方向是專注於免疫細胞的功能基因組學，基於 CRISPR 基因組編輯方法篩選影響免疫細胞命運和功能的基因，並探索這些方法的應用潛力。

2015 年，

Alex Marson

小組與

Jennifer Doudna

實驗室合作，首次證明可以無需病毒載體將短 DNA 模板插入免疫細胞，即採用電穿孔的方式瞬時提高細胞膜的通透性，從而 DNA 引入免疫細胞中。

2018 年，研究團隊開發了一種基於 CRISPR 將更長 DNA 序列片段剪下並貼上到免疫細胞的方式；2019 年，他們發現了一種可與 Cas9 酶結合的改良版 DNA 模板，可更高效將 DNA 序列遞送到目標基因組位點。

經過多年的積累，在最新的研究中，該團隊進一步提升了基因編輯效率和生產重程式設計細胞的產量。

我們知道，DNA 以單鏈或雙鏈形式存在，而 Cas9 附著在雙鏈 DNA 上。高濃度雙鏈 DNA （dsDNA） 能夠提高 CRISPR 介導的基因插入效率，然而也可能會對原代細胞產生毒性。因此，這種方法只能用少量雙鏈 DNA 模板，這會導致編輯效率偏低。

研究團隊發現，與之相比，單鏈 DNA 對細胞的毒性更低，即使是相對高濃度的單鏈 DNA 對細胞的毒性也比較低。在最新的研究中，團隊透過在單鏈模板 DNA 末端新增一小段雙鏈 DNA 突出端，這樣就可以將經過修飾的 Cas9 靶序列連線到單鏈模板 DNA。

▲圖|ssDNA CTS 模板和小分子雞尾酒可以提高非病毒基因敲入的產量和純度

圖源：Nature Biotechnology

“這種新方法在基因編輯效率和毒性上實現了一種巧妙的平衡。”

Alex Marson

說。

研究人員發現，與雙鏈 DNA 靶序列相比，這種新方式能夠將人原代 T 細胞和其他造血細胞的基因編輯效率提高1倍以上，敲入效率和產量平均提高約 2 到 3 倍，分子的雙鏈末端能夠讓研究人員可以使用 Cas9 增強非病毒載體進入細胞的能力。

然後，研究人員評估了一系列已被報道可以提高原代人 T 細胞敲入效率的小分子雞尾酒化合物，包括DNA 依賴性蛋白激酶 （DNA-PK） 抑制劑 NU7441 和 M3814，組蛋白去乙醯化酶 I/II 類抑制劑 Trichostatin，CDC7 抑制劑 XL413 等多種化合物。他們發現這些小分子化合物能夠增強同源定向修復能力，並進一步將敲入效率平均提高 2 到 3 倍左右。

論文中還寫到，這種方法適用於各種目標基因位點、敲入模型和主要人類細胞型別（包括人原代T細胞），同源定向修復效率為 80%–90%。

接下來，研究團隊還探索了非病毒模板的臨床應用潛力，尤其是在治療和診斷性基因替換。研究人員指出，這種新方式首次可以完全替換與罕見遺傳免疫疾病相關的兩個基因，即 IL2RA 和 CTLA4 基因。

最後，研究團隊還展示了一種基於完全非病毒載體生產臨床級別（GMP）CAR-T 細胞的工藝，這些細胞在體外和小鼠模型中均高效清除癌細胞。

▲圖|與GMP相容的非病毒 CAR-T 細胞製造過程

圖源：Nature Biotechnology

在研究團隊使用新單鏈 DNA 模板生產 CAR-T 細胞的過程中，第 7 天的平均敲入效率為 40。4%，第 10 天為 45。8%。第 7 天，CAR+細胞的最終產量超過 5×10^8，到第 10 天超過 1。5×10^9；T 細胞重程式設計為 CAR-T 細胞的轉化率約為 50%，產量在患者所需的治療疾病範圍內（50-400×10^6 CAR+）。也就是說，一次操作可以設計超過 10 億個細胞。

有望開發“下一代”基因和細胞療法

研究團隊也十分看好這種非病毒載體工程方法的臨床應用潛力。

Brian R。 Shy

指出，使用病毒載體既昂貴又耗費資源，基因工程非病毒方法的一個主要優勢是有望突破成本、製造複雜性和供應鏈挑戰等多種限制。我們的完全非病毒策略既降低了高濃度雙鏈 DNA 模板的毒性，也有潛力降低重程式設計 T 細胞的成本和流程的複雜性。

該論文的另一名作者、UCSF 助理教授兼格拉德斯通研究所副研究員

Jonathan Esensten

認為，這項技術有可能使細胞和基因療法的開發更快、更好、成本更低。

研究團隊表示，這種方式會是一種很有前景的方法，為開發下一代基因和細胞療法提供了平臺性技術。在論文中，研究團隊已經展示了這種非病毒基因組工程方法在基因診斷、基因替換治療以及合成結構（比如說靶向插入 CAR）上的潛在應用價值。

比如說，利用這種新方式建立了一個完全非病毒的 T 細胞工程平臺，生產了超過 10 億個針對多發性骨髓瘤的 CAR-T 細胞。“將 DNA 模板靶向基因組中的特定位點 TRAC ，將提高 CAR-T 細胞的抗腫瘤效力。這種新的非病毒方法能夠幫助大家更高效實現這一目標，這將加速下一代 CAR-T 細胞療法的開發。”參與這項研究的一名研發人員說。

研究團隊還指出，這種方法也可以拓展到其他相關的細胞型別，如造血幹細胞、B 細胞和自然殺傷細胞。目前，正在進行臨床前驗證工作，進一步建立和最佳化非病毒的T細胞工程平臺。

另一方面，他們還利用這種新方法改寫基因突變導致罕見遺傳性免疫疾病的基因序列。研究中論證了單鏈 DNA 模板方法應用於一系列人細胞型別的可行性，同時還可以拓展到其他應用中，包括靶向與原發性免疫缺陷病相關超 400 個基因，或者合成更多生物學結構。

“過去，科學家們已經證明可以替換特定患者發生突變的 IL2RA 基因的一小部分。現在，我們團隊證明可以一次性替換整個 IL2RA 和 CTLA4 基因。這種‘一刀切除’的方法，可以治療任何出現 IL2RA 和 CTLA4 基因突變的患者，而無需為每個患者的突變生成個性化模板。近 90% 利用這種基因工程方法修飾的細胞恢復了正常。”

Alex Marson

說。

Alex Marson

在官方通稿中指出，正在推進在 CAR-T 細胞療法和缺乏白細胞介素 2 受體 α 自身免疫疾病治療中使用非病毒 CRISPR 技術的臨床試驗。

參考資料：

1。

https：//www。nature。com/articles/s41587-022-01418-8

2。

https：//www。nature。com/articles/s41587-022-01420-0

3。https：//gladstone。org/news/cellular-engineering-breakthrough-high-yield-crispr-without-viral-vectors