撰文 | 苗馨芳  責編 | 周葉斌

神經母細胞瘤 （neuroblastoma，NB） 是兒童期最常見的顱外實體癌，其常見的腫瘤基因組變異是MYCN 基因擴增（MYCN-A）。與 MYCN 未擴增 （MYCN-NA） 比，MYCN擴增（MYCN-A）型腫瘤的患者總生存期更短，轉移風險更高。可靶向 MYCN 或其他 NB 核心調控轉錄因子仍然是一大挑戰，基因組研究僅在不到 10% 的神經母細胞瘤中發現了可成藥的體細胞突變。近期，抗 GD2 單克隆抗體與GM-CSF和異維甲酸聯用的免疫治療顯示出療效，成為高危 NB 的治療標準。儘管抗 GD2 免疫療法為患者帶來了預後改善，但神經母細胞瘤患者總體存活率仍然很低。因此，需要額外的療法來治療這種高度侵襲性的癌症。

CAR-T細胞療法可有效治療難治性和複發性B細胞白血病和淋巴瘤，其中6種靶向CD19或BCMA的CAR-T治療獲得FDA批准。然而，由於腫瘤相關抗原 （TAA） 的異質表達，不利的腫瘤微環境等原因，這些積極的療效並未在實體瘤中重現。

迄今為止，六種NB-TAA正在作為CAR-T療法的靶點被開發，包括GD2，L1-CAM （CD171） ，Glypican-2 （GPC2），CD276 （B7-H3） ，ALK和NCAM。只有針對GD2、L1-CAM和CD276的CAR-T療法進入臨床試驗。儘管這些療法在4項臨床試驗中顯示出安全性，但它們的療效和T細胞永續性有限，很少有患者達到完全或部分緩解。除了GD2和L1-CAM，最近的研究表明 GPC2和CD276有希望成為免疫治療的細胞表面靶標。GPC2和CD276在包括NB在內的多種兒科癌症中均顯著過表達，而在正常組織中表達低或檢測不到。GPC2對發育中的神經系統中神經元的生長和分化至關重要。而CD276是一種參與腫瘤免疫逃避和轉移的檢查分子。在腫瘤血管中也觀察到CD276的表達增強，其過度表達與許多癌症的不良預後相關。此外，上述針對CD276的CAR-T細胞臨床試驗目前正在包括NB在內的實體瘤中進行。這些特徵及其在細胞表面的位置使它們成為NB的有希望的免疫治療靶點。儘管在臨床前研究中有關於靶向GPC2或CD276有效的報道，但尚未確定CAR-T的效果。

2022年8月15日，

Javed Khan

團隊在

The Journal of Clinical Investigation

上發表了題為

An optimized bicistronic chimeric antigen receptor against GPC2 or CD276 overcomes heterogeneous expression in neuroblastoma

的文章。

該研究使用BiCisCAR靶向多種TAA可以克服實體瘤中靶抗原的異質表達，並確定了一種有效的、臨床相關的針對NB的CAR。

首先，

GPC2和CD276在NB腫瘤和細胞系中異質表達。

GPC2和CD276被認為是NB免疫治療的兩個有希望的靶標。然而，TAA的異質表達是一種常見現象，會導致腫瘤免疫逃逸，從而限制 CAR-T 細胞治療實體瘤的療效。在對194個NB腫瘤和40個NB細胞系進行測序後，研究人員證實GPC2和CD276與正常組織中的表達水平相比高表達，但在樣本之間顯示出顯著的異質性。此外，GPC2和CD276表達水平與腫瘤的MYCN擴增狀態無關。GPC2和CD276的聯合表達分析顯示，在大約95%的NB樣本中高表達。

GPC2和CD276在NB腫瘤和細胞繫上高度和異質性表達

其次，

P-COCC揭示了個體CAR-T細胞活性特徵。

P-COCC是一種彙集了多模式單細胞分析方法，透過對CAR構建體的結合域進行測序來同時鑑定CAR-T細胞，並使用28種蛋白質標記物透過CITE-Seq確定T細胞功能。為了評估哪些CAR-T細胞具有最高活性，研究人員接下來測量了所有14種CAR-T細胞型別的CD8+效應T細胞的變化。在8種抗GPC2 CAR中，CT3 CAR-T細胞中簇11的頻率增加最多，從17%增加到44%。與其他7種抗GPC2 CAR-T細胞相比，受刺激的CT3 CAR-T細胞顯著上調了參與抗腫瘤活性和增殖能力的基因的表達。同時研究人員檢測了抗CD276 CAR-T細胞之間的差異。在6種抗CD276 CAR中，與其他5種構建體相比，MGB7H3-LH CAR表現出更高的趨化因子基因表達。總體而言，

使用P-COCC的方法揭示了CT3和MGB7H3-LH作為CAR-T細胞，分別具有啟用的效應T細胞特徵以及抗GPC2和CD276 CAR的多功能性。

P-COCC確定了具有更高啟用和抗腫瘤多功能特徵的最佳抗GPC2 CAR CT3

此外，

細胞毒性試驗證實CT3和MGB7H3-LH分別是靶向GPC2和CD276的最有效的CAR構建體。

CT3 CAR-T細胞以1：1的效應/靶 （E/T） 比率介導了對錶達高水平GPC2的非MYCN擴增細胞的最有效殺傷，併產生很多抗腫瘤效應的細胞因子。對於抗CD276 CAR，所有6種候選CAR-T細胞均顯示出對NB細胞的高度特異性殺傷活性。其中，MGB7H3-LH CAR-T細胞對NB細胞的殺傷活性最高。因此， P-COCC分析與細胞毒性和細胞因子分析一致，證明了CT3 CAR是最有效的抗GPC2 CAR，以及MGB7H3-LH是最有效的抗CD276 CAR構建體。

14 種CAR的細胞毒性測定證實CT3是最有效的靶向GPC2的CAR，MGB7H3-LH是最有效的靶向 CD276的CAR

BiCisCAR-T細胞在體外殺死共表達GPC2和CD276的NB細胞方面表現出強大的活性，且GPC2/CD276 BiCisCAR對錶達GPC2或CD276的腫瘤細胞表現出優異的抗腫瘤活性。

BiCisCAR可切割T2A序列連線的2個完整CAR結構，併為兩者使用4-1BB共刺激結構域結合劑，允許兩種構建體在同一個T細胞中共表達。體外細胞溶解試驗表明，這種BiCisCAR具有與高密度GPC2和CD276和中等水平抗原密度的NB細胞相當的殺傷能力。

靶向GPC2和CD276的BiCisCAR-T細胞在體外顯示出有效的NB細胞殺傷活性

在小鼠模型中，抗GPC2和抗CD276 CAR-T細胞在33。3%的小鼠中適度抑制甚至消除了腫瘤，但抗CD276 CAR和BiCisCAR表現出了更好的療效。此外，BiCisCAR-T細胞在第28天顯示出比其他單個CAR更高的百分比，表明其具有長期抗腫瘤活性。

小鼠細胞中單GPC2或CD276靶向CAR或BiCisCAR治療

最後，

BiCisCAR-T細胞在轉移性異質模型中表現出卓越的功效，具有更長的永續性並減少衰竭。

為了模擬GPC2和CD276的異源表達，研究人員使用了穩定表達GPC2或CD276的NALM6細胞混合物，並用 BiCisCARs或單抗原靶向CARs處理它們。實驗表明，在用BiCisCAR-T 細胞處理的小鼠中，無論是表達GPC2還是表達CD276的NALM6細胞均不可檢測，且這些小鼠的生存期也顯著延長，表明了與單靶點 CAR-T細胞相比，BiCisCAR-T細胞的抗腫瘤能力有所提高。之後，研究人員白血病細胞表達GPC2或CD276的模型中，測量了CAR-T細胞輸注21天后小鼠脾臟中CAR-T細胞的比例，進一步證明了BiCisCAR 在GPC2和CD276異質表達的腫瘤模型中具有更長的永續性並且不易衰竭。在NB異質小鼠模型中與NALM6實驗一致，BiCisCAR-T細胞也顯著抑制了腫瘤進展。

BiCisCARs在根除異質表達GPC2或CD276的腫瘤細胞、改善T細胞永續性和減少T細胞耗竭方面表現出卓越的功效

綜上所述，

該文章描述了一種多模式分析來識別有效的候選CAR構建體，該構建體允許識別顯示最大擴增、啟用特徵和抗腫瘤細胞毒性的T細胞。

這種多模式方法可用於系統地篩選多個TAA的多個CAR構建體，以最佳化CAR開發。研究人員

開發了一種針對表達GPC2或CD276的NB的強效BiCisCAR，其在體內表現出永續性、不易衰竭和更多的記憶特性，

有潛力成為一種新的免疫療法用於NB高危患者。

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責編

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排版 | Sheila   校對 | uu