“罕見”但重要，RET融合檢測助力實現NSCLC精準診療
韓昱晨教授：在本研究中，我們選擇RET基因作為研究物件主要基於兩個方面的原因：
首先，RET融合這個靶點非常重要。肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率位居我國惡性腫瘤前列。近十餘年來，靶向治療藥物極大地延長了驅動基因陽性晚期NSCLC的生存期，也使這些患者的生活質量得到了明顯提高。隨著基因檢測技術，尤其是二代測序（NGS）技術的發展與臨床應用，除常見驅動基因變異（如EGFR、ALK等基因變異）以外，越來越多的罕見基因變異（如RET融合、MET擴增或exon 14跳躍、ROS1融合等）也被檢測到並在臨床得到應用。
“罕見”是指這一類基因變異的發生率較低，但這並不代表攜帶這些基因變異的患者的絕對數量少。我國NSCLC患者中RET融合的發生率約為1。4%~2。5%，但以我國每年的NSCLC新發病例數來估算，中國每年新發RET融合陽性NSCLC患者可以達到上萬人。而這些數以萬計的RET融合陽性的NSCLC患者可以從針對RET融合的靶向治療中獲益。
第二，目前臨床上針對RET融合檢測方法的選擇非常重要。隨著藥物研發的進步，針對罕見基因變異的靶向藥物層出不窮，並展現出顯著的臨床療效。2021年3月24日，普拉替尼正式獲得中國國家藥品監督管理局（NMPA）批准，用於既往接受過含鉑化療的RET基因融合陽性區域性晚期或轉移性NSCLC成人患者，成為首個在中國獲批的RET抑制劑。另一款RET抑制劑Selpercatinib已在美國獲得FDA批准，但尚未在國內上市。這些RET抑制劑的出現，為更多RET融合陽性的NSCLC患者帶來獲益，也使得規範檢出攜帶有RET融合的NSCLC成為目前臨床的當務之急。
基於這些背景，2021版《CSCO非小細胞肺癌診療指南》對RET融合檢測做了更新，對於不可手術的III期及IV期NSCLC患者，RET融合檢測上升至與EGFR、ALK、ROS1基因檢測並行的I級推薦檢測。這意味著NSCLC患者可能需要更廣泛地進行RET融合檢測，以篩選出可能從RET抑制劑治療中獲益的RET融合陽性患者，為這類患者提供最大化的治療獲益。
此外，RET融合也是EGFR-TKI及ALK-TKI獲得性耐藥機制之一。抗癌管家-康愛管家，我們一起抗癌，治癒癌症不是夢。因此，RET融合的檢測對於EGFR-TKI及ALK-TKI耐藥患者的預後及耐藥後治療也有指導意義。對於接受過EGFR-TKI或ALK-TKI並耐藥的患者，推薦其進行RET融合檢測，檢測陽性的患者可以接受RET抑制劑治療。
多種檢測手段應用於RET融合檢測，新的非經典RET重排不斷被發現
向嬋博士：對於融合基因檢測，目前常見的檢測方法包括免疫組織化學（IHC）、熒光原位雜交（FISH）、實時熒光聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、基於NGS平臺的DNA測序（DNA-seq）和RNA測序（RNA-seq）等，不同的方法都有各自的優缺點。
IHC在臨床病理診斷中廣泛應用。研究表明IHC檢測RET融合的靈敏度為50%~100%，特異度為30%~90%。在IHC的實際操作過程中，存在抗體選擇多樣、參照標準不明確等問題。因此，目前IHC未被ESMO推薦作為RET融合檢測的常用手段。
FISH是檢測基因易位/融合的“金標準”。其優點在於對腫瘤細胞的含量要求較低（樣本中存在50個以上的腫瘤細胞即可進行判讀），但是在檢測RET融合時也存在以下幾個弱點：首先，FISH檢測不能提供關於融合伴侶的充分資訊；其次，FISH檢測對於操作和判讀要求相對較高，需要有經驗豐富的醫師進行結果的判讀；再者，FISH只能檢測DNA水平的RET基因重排，但對於RNA水平未產生實質性基因融合的病例，FISH可能會出現假陽性的情況。除上述因素外，FISH檢測KIF5B-RET、CCDC6-RET等經典RET融合的靈敏度很高，達95%以上，而其他非經典融合如NCOA4-RET靈敏度較低，僅為66。7%。
RT-PCR是我們分子檢測最常用的方法之一。RT-PCR法檢測RET融合的特點在於快速、簡便易行、能同時明確RET已知的融合型別等，但RT-PCR不能檢測未知RET融合型別，因此存在假陰性可能。
DNA-seq的NGS在臨床上的應用也較廣泛。在DNA水平上可以同時檢測到包括已知和未知位點在內的所有RET基因易位，但是準確性會受捕獲探針的覆蓋度、標本DNA質量，以及生物資訊學分析等關鍵因素影響。且DNA水平檢測到的融合斷裂位點可能並不代表RNA水平的融合位點，在極少數情況下，DNA水平上檢測到的基因易位並不會引起融合基因的表達。目前文獻報道DNA-seq的靈敏度為87。2%~100%，特異度為98。1%~100%。因此，基於DNA的靶向測序分析通常輔以RNA測序方法驗證。
RNA-seq的NGS平臺檢測RET融合基因，包括基於擴增子的RNA測序和基於靶向捕獲的RNA測序。基於擴增子的RNA測序檢測範圍一般僅侷限於特定的常見融合型別，罕見融合可能會漏檢。基於靶向捕獲的RNA測序其準確性也受到探針覆蓋度、生信分析等因素影響。此外，由於RNA很容易降解，RNA-seq對樣本質量要求也比較高。
總的來說，隨著DNA-seq 的廣泛應用，越來越多不常見的RET重排被發現。那麼這些DNA水平的非經典RET重排的臨床意義是怎樣的？它們是否能夠產生功能性框內融合轉錄本，從而使得患者可以從RET靶向治療中獲益？基於這些問題，我們進行了相關探索。
DNA-seq與RNA-seq檢測相結合探尋NSCLC中非經典RET融合的臨床意義
向嬋博士：在本研究中，我們回顧性納入了149例透過DNA-seq檢出攜帶RET重排的NSCLC病例。KIF5B-RET和CCDC6-RET是兩種重要的經典RET融合，除KIF5B-RET和CCDC6-RET融合之外的RET融合都被歸類為非經典RET融合。因此，本研究中非經典RET重排包括：
1） 重排的伴侶基因不是KIF5B和CCDC6；或
2） 重排的伴侶基因尚未被報道；或
3） 與基因間區域融合的重排，包括基於DNA-seq結果預測的框外RET轉錄本；或
4） 存在不止一種RET融合的重排。
根據DNA-seq檢測結果，我們排除了90例只攜帶KIF5B-RET或CCDC6-RET融合的病例，進一步排除5例樣本量不足的病例後，54例攜帶有非經典RET重排的病例被納入後續的RNA-seq檢測。
經過RNA-seq資料質控後，最終我們納入了44例攜帶非經典RET重排的配對DNA-RNA測序資料進行比較分析。分析顯示，44例樣本中有41例在RNA水平上檢出了RET融合。在進一步分析中，我們根據DNA-seq是否檢測到保留RET-3’端的重排（即是否保留其完整激酶活性域），以及透過DNA層面的RET重排預測是否產生閱讀框內RET融合，將44例樣本分為三組：
● A組：DNA層面RET基因重排保留 3’端，且預測能產生閱讀框內融合（33例，75%）；
● B組：DNA層面RET基因重排保留 3’端，且預測產生移碼/框外融合（9例，20。5%）；
● C組：DNA層面僅檢測到RET基因 5’端重排（2例，4。5%）。
分析發現，A組中96。9%的樣本在DNA水平的RET重排也可在RNA水平被檢測到，一致性最高；B組中88。9%的樣本RNA-seq檢測到了功能性RET融合轉錄本；C組中有一例樣本在RNA水平上檢測到真實的融合轉錄本。基於以上分析，我們得到一個初步結論，即在DNA水平上檢測到的大部分非經典RET重排都可以在RNA水平上得到驗證。
值得一提的是，在本研究中有一例IV期並伴骨轉移的患者，既往接受過多線化療及免疫治療。在治療失敗之後，透過NGS檢測發現該患者同時攜帶有經典的KIF5B-RET融合及一種非經典RET-FAM107B融合。之後患者接受了RET抑制劑治療，目前治療已持續13個月，且仍在治療中。這一病例說明同時攜帶經典和非經典RET融合的患者可以從RET抑制劑治療中獲益。可惜的是，本研究中僅有這一例患者接受了RET抑制劑治療，研究中發現的其他非經典RET融合對於RET抑制劑治療的有效性還需要臨床持續地關注。
不同型別非經典RET重排在DNA/RNA水平表現不一，進一步指導臨床RET融合鑑定與驗證
韓昱晨教授：這項研究結果對我們的臨床實踐很有意義。隨著DNA-seq被應用於臨床實踐，有更多RET重排被檢測出來。如果DNA-seq檢測出攜帶KIF5B/CCDC6-RET以外的非經典RET重排，則可以根據以下情況選擇是否進行RNA水平的驗證：
如果DNA-seq檢出的RET重排保留RET 3’端，且預測可以產生框內融合，那麼在RNA水平檢出相同RET融合的可能性非常高，對於這類樣本可以不進行RNA水平的驗證；
如果DNA-seq檢出的RET重排保留RET 3’端且預測產生移碼/框外融合，或者DNA-seq只檢測出RET 5’端的重排，那麼在RNA水平可能具有與DNA水平不同的融合伴侶和融合位點。抗癌管家-康愛管家，我們一起抗癌，治癒癌症不是夢。這類樣本建議在RNA水平進一步進行驗證，採用的驗證手段有RT-PCR或RNA-seq。RNA-seq是最理想的驗證方式，但其檢測週期長，需要的樣本量較多，且對樣本的質量要求也高，如果有足夠腫瘤組織樣本理想情況下進行DNA-seq、RNA-seq配對檢測。RT-PCR檢測平臺較普遍、操作更簡便且檢測週期相對快，在臨床科室中更容易開展。因此，如果不具備RNA-seq的條件，可以選擇更經濟便捷的RT-PCR法進行驗證。
另一方面，本研究中有一例同時攜帶經典與非經典RET融合的病例對RET抑制劑治療有效，其對RET抑制劑治療有反應的作用機制也尚不清晰，還需要我們篩選到更多這種型別病例的臨床資料進行相關探索與分析。相信隨著RET基因病理樣本的積累，未來會有更多、更新的RET基因融合位點被發現，而攜帶這些RET融合的患者能否從RET靶向治療中獲益，以及會有多大程度的獲益，也是非常值得我們去探索研究。
病理醫師透過專業、規範化檢測實現RET融合精準檢測和治療
韓昱晨教授：基於目前的臨床實踐，準確檢測RET融合是實施RET抑制劑治療的前提。如何更好地在臨床實踐中開展RET融合檢測，2021版《中國非小細胞肺癌RET基因融合臨床檢測專家共識》（以下簡稱《共識》）給出了很多規範化建議。《共識》指出，在進行RET融合檢測前，均需要由專業的病理醫師對檢測所採用的組織樣本或者細胞學樣本進行腫瘤細胞含量評估，並根據樣本型別、腫瘤細胞含量、樣本質量合理選擇檢測方式。因此，病理醫師在RET融合檢測中起到至關重要的作用。病理醫師透過專業、規範化的操作準確評估腫瘤樣本，並選擇合理的檢測方法，這是實現RET基因規範化檢測與精準診斷中非常重要的一環。只有這樣才能獲得可靠的檢測結果，為臨床開展針對個體的精準化治療提供有益的幫助，最終幫助患者得到最大限度獲益。
本文轉自腫瘤資訊（由“抗癌管家網站-康愛管家”轉載分享）