原文作者：Scott Plevy
NOD2
基因突變是克羅恩病（Crohn’s disease）發病的危險因素。許多關於NOD2突變的具體致病機制的問題仍懸而未決。這一有關所涉致病細胞群的新發現為克羅恩病提供了新的治療方向。
克羅恩病是一種影響著許多人健康的慢性炎症性腸病（inflammatory bowel disease， IBD）。比如加拿大和德國超過0。3%的人口都患有克羅恩病，而它在世界範圍內的發病率也在增加［1］。我們一方面需要更好對症下藥，但另一方面，缺乏對其成因的瞭解阻礙了克羅恩病治療上的進展。Nayar等人［2］在《自然》上發文，解開了關於克羅恩病一項危險因素的長久謎團，他們的發現具有重大的臨床意義。
克羅恩病會對腸道多方面產生影響。其中最常見的是在迴腸產生的區域性影響，導致往往會引起纖維化的炎症（損傷從而引起纖維組織沉積反應）。而這進一步導致了迴腸內腔收縮（或狹窄），需要依靠手術干預緩解［3］。克羅恩病為基因和環境互相作用介導的疾病提供了一個有用的模型。這種情況下，腸道微生物引起的致病炎症反應背後是遺傳易感性。
NOD2遺傳變異
（或稱作遺傳多型性）
與克羅恩病的遺傳風險關聯性最強，克羅恩病致病風險因素中約20%與NOD2基因的三個單核苷酸多型性
（single nucleotide polymorphisms， SNP）
相關
［4］。此外，NOD2突變是克羅恩病中發生迴腸狹窄和手術需要的重要預測因素，這一疾病遺傳基礎和疾病表現間的關聯在此前也已經獲得廣泛的證實［3］。
然而，將NOD2基因和克羅恩病易感性相關聯卻呈現為一種悖論。NOD2是一種細胞內受體（圖 1），它識別胞壁醯二肽（Muramyl Dipeptide， MDP）——一種遍佈細菌細胞壁的分子。在NOD2被描述為克羅恩病致病相關基因之前，NOD2的功能普遍在參與先天免疫的免疫細胞中得以認知。這些免疫細胞的NOD2一旦活化，會引起細胞因子這一炎症分子的基因表達，而異常強烈的炎症反應可介導克羅恩病中的腸道損傷［5，6］。人們可能以為，當NOD2發生功能失活突變時（LOF， 即攜帶這一突變的基因被編譯時不會產生具備完整功能的蛋白）能保護患者不得克羅恩病。但實際上，NOD2功能失活突變卻被確定是克羅恩病的危險因素。因此後續的研究將重點都轉向了NOD2生物學在腸道中的各個方面，研究具備功能性NOD2如何維持腸道穩態，那裡有著人體中最多數量、持續被暴露在腸道菌群MDP中的免疫活性細胞，以及NOD2突變如何打破這種穩態從而致病［5］。（注：斜體的NOD2代表基因，非斜體的代表受體。下同）
圖1 | 腸道炎症性腸病（IBD）的分子生物學基礎。
克羅恩病的成因尚未完全闡明。
a,
NOD2是一種可識別細菌醯二肽MDP的胞內蛋白，常見於腸道細胞中。是免疫細胞維持腸道穩態的正常保護反應中的一部分。
b,
可產生非功能性版本蛋白的NOD2突變是克羅恩病發病的危險因素之一［4］。透過對斑馬魚和臨床樣本的研究，Nayar等人［2］揭示了 NOD2突變相關的具體發病機制。研究者們確定了多組被活化的免疫細胞群，即巨噬細胞和成纖維細胞，它們造成了纖維化——一種克羅恩病患者腸道的迴腸區域發生的組織異常。配體與這些免疫細胞的細胞因子受體亞基gp130結合後會觸發一系列STAT3調控的基因表達。
c,
據該研究報告，一種名為bezedoxifene的gp130小分子抑制劑在斑馬魚模型中成功阻斷了引起損傷的相關基因表達。
在這一研究之前，我們並不知曉NOD2突變在迴腸纖維化形成中的作用。論文作者探究了克羅恩病中炎症和纖維化的驅動因素，並透過人體細胞、人體腸道組織及斑馬魚模型的研究來將這些生物學發現與NOD2關聯起來。
首先，研究者們對手術中取得的克羅恩病患者發炎的迴腸樣本組織進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）。這些細胞顯示出與巨噬細胞及成纖維細胞活化相關的基因表達特徵。他們還確認了一種關鍵的細胞型別，這種細胞兼具髓樣細胞譜系標誌物和成纖維細胞譜系的標誌物的雙重表達。
這些發現表明迴腸中有一組炎性巨噬細胞會隨著病程進展分化為啟用的成纖維細胞。
值得注意的是，研究者們利用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的斑馬魚腸炎模型，證實了這些細胞群具備進化上的保守性。DSS長期以來被用於建立標準的齧齒類動物腸道損傷和炎症模型。此前，人類炎症性腸病的體內模型一直被小鼠模型所主導。而現在，如同Nayar和同事所展示的那樣，斑馬魚也可以被用於相對高通量研究以及疾病相關性的快速評估。斑馬魚和人類腸道有形態上的相似性，此外，斑馬魚和人類一樣，它們的免疫防禦反應也有先天和後天兩個分支，並且斑馬魚腸炎的發生也取決於腸道微生物群落［7］。諸如CRISPR這樣的基因編輯工具幫助快速對斑馬魚中的目標基因進行編輯。
作者以nod2缺失的斑馬魚作為腸炎的研究物件。與攜帶正常nod2的斑馬魚相比，
nod2缺失的斑馬魚在經過DSS誘導之後，他們的腸道有明顯白細胞增多這一炎症標誌。
但是斑馬魚的模型只有在建立起與人類的相關時才有意義。
對此，透過新確診為克羅恩病的兒童的資料，作者證明了NOD2突變複製數的增加
（與克羅恩病風險相關）
，確實與迴腸組織中巨噬細胞及成纖維細胞表達特徵增高相關。
為了理解NOD2在能夠體外分化的人體細胞中的作用，作者採用了健康志願者的外周血單個核細胞（peripheral blood monocyte），並確定這些細胞是否攜帶與克羅恩病易感性相關的NOD2突變及突變複製數量（0條、1條、2條）。隨後研究者在體外將這些細胞在有MDP和無MDP的條件下分化。
他們觀察到比起攜帶野生型NOD2的細胞，攜帶兩條NOD2突變的外周血單個核細胞分化而來的活化成纖維細胞數量更多。
此外，NOD2突變數量的增加與具有活化細胞基因表達特徵的成纖維細胞數量相應的富集相關。有趣的是，與攜帶野生型nod2的斑馬魚相比，在有MDP的條件下，缺失nod2的斑馬魚即使在從DSS導致的損傷恢復期間，也會持續表達具有活化成纖維細胞特徵的基因。這些資料表明nod2缺失會抑制從纖維化或炎症中的有效恢復。
為了進一步闡明NOD2風險突變相關的纖維化基因表達特徵的分子基礎，作者搜尋了該通路上游轉錄調控元件。他們發現在活化的成纖維細胞及巨噬細胞中，編碼STAT3的基因有著顯著的上調。STAT3轉錄調控炎性腸病中炎症和纖維化反應中關鍵成分，並透過細胞因子受體gp130起作用。臨床資料分析表明，對靶向抗腫瘤壞死因子（TNF）蛋白治療（抗TNF是常見的克羅恩病治療方法）無反應的克羅恩病患中，gp130所調控的編碼IL-6、抑癌蛋白M、IL-11的基因均有所上調。這一發現佐證了在這些抗藥性病人中gp130訊號傳導的作用。
作者假設阻斷gp130或可減輕NOD2突變造成的異常。他們對經過MDP處理的攜帶NOD2突變的人體細胞進行gp130阻斷劑bazedoxifene處理，驗證這一假設。Bazedoxifen確實降低纖維化基因表達特徵，而且逆轉了活化成纖維細胞性所特有的形狀變化。這一製劑還減輕了攜帶nod2突變斑馬魚由DSS處理引起的腸道損傷。
從克羅恩病中纖維化的臨床特徵著手，該研究闡釋了NOD2突變引起的克羅恩病的相關分子通路，並在結論中提供了應對纖維化和抗TNF藥物耐藥這些緊迫臨床問題的潛在見解。這項研究以遺傳學基礎和臨床結果支撐這一細胞和分子通路，從而為目前及未來克羅恩病的治療開闢了道路。
目前仍存在著許多有意義的調查方向。NOD2是唯一一個目前已知的MDP識別通路，但這項研究表明MDP也可在nod2缺失的斑馬魚中引起一系列細胞及分子層面變化。這意味著仍存在未發現的MDP訊號通路。Bazedoxifene起初被歸類為選擇性雌激素受體抑制劑［8］，這也引發一定顧慮，如果該藥物被用作克羅恩病治療，可能會給其他通路帶來副作用。gp130受體存在著多個可與之結合的配體，從而可產生廣泛的免疫反應。因此，相較於全面抑制gp130訊號通路，或靶向如JAK激酶等（治療克羅恩病的JAK激酶抑制劑正處於後期臨床開發階段）其他臨床相關的訊號通路而言，瞭解配合NOD2介導分子事件的特定gp130受體，可能會帶來更有效、更安全的治療干預。
並非每個克羅恩病患者都有與疾病風險相關的NOD2突變。事實上，在特定族群個體如華裔、馬來裔、印度裔中，迴腸疾病雖是克羅恩病的顯著臨床特徵，但NOD2與這些人群的疾病風險並無關聯［5，9］。或許活化的巨噬細胞和成纖維細胞的分子特徵是不同患有迴腸克羅恩病個體的相關統一特徵。很有可能不同的遺傳背景會帶來相同的臨床和分子結果。因此，Nayar及其同事的研究結果讓這個領域朝著克羅恩病的分子分類更進一步，該分類或將闡明這種複雜的病症，它有著約200個與疾病風險相關聯遺傳區域［10］和多種臨床表現。
封面來源：Unsplash
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原文以A molecular connection hints at how a genetic risk factor drives Crohn’s disease標題發表在2021年4月19日的《自然》的新聞與觀點版塊上
nature
doi: 10.1038/d41586-021-00979-z
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